АмплиСенс Treponema pallidum (Диагностикум сифилиса)

Торговое название: АмплиСенс Treponema pallidum

Международное название: Диагностикум сифилиса&

Фармакологическая группа: МИБП-диагностикум

Фармакологическая группа по АТХ: V04CX. Другие диагностические средства

Показания к применению:

Тест-система "АмплиСенс" Treponema pallidum" предназначена для выявления ДНК Treponema pallidum из мазков (соскобов) слизистых оболочек, серозного экссудата из высыпных элементов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Методы применения и принцип действия:

Тест-система рассчитана на 100 постановок, включая контрольные образцы.

ОПИСАНИЕ.

Тест-система включает 3 комплекта реагентов.

Комплект № 1: "ДНК-сорб-А"

Комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала.

Комплект № 2: "АмплиСенс-100" или "АмплиСенс-100-R"

Комплект реагентов для амплификации участка ДНК Treponema pallidum (метод ПЦР).

Комплект № 3: "ЭФ-200"

Комплект реагентов для электрофоретического анализа амплифицированной ДНК.

Комплект № 1 "ДНК-сорб-А" включает:

Реактив	Описание	Объем (мл)	Кол-во
Лизирующий раствор	Прозрачная бесцветная жидкость	30	1 флакон
Отмывочный раствор	Прозрачная бесцветная жидкость	100	1 флакон
Сорбент универсальный	Суспензия белого цвета	1,0	2 пробирки
ТЕ-буфер для элюции ДНК	Прозрачная бесцветная жидкость	5,0	2 пробирки

Дополнительно к комплекту "ДНК-сорб-А" прилагаются следующие реактивы:

Реактив	Описание	Объем (мл)	Кол-во
Транспортная среда для мазков	Прозрачная жидкость светло-желтого цвета, допускается наличие слабо выраженного осадка	30	1 флакон
ВКО комплексный - внутренний контрольный образец	Прозрачная бесцветная жидкость	1,0	1 пробирка
Отрицательный контрольный образец (ОКО)	Прозрачная жидкость светло-желтого цвета, допускается наличие слабо выраженного осадка	1,6	1 пробирка

Комплект рассчитан на выделение ДНК из 100 проб, включая контрольные образцы.

Комплект № 2 "АмплиСенс-100" или "АмплиСенс-100-R" включает:

Реактив	Описание	"АмплиСенс-100"		"АмлиСенс-100-R"
		Объём (мл)	Кол-во	Объём (мл)	Кол-во
ПЦР-смесь-1	Прозрачная бесцветная жидкость	0,55	1 пробирка	0,005	110 пробирок
ПЦР-смесь-2 red	Прозрачная жидкость красного цвета	1,2	1 пробирка	1,2	1 пробирка
Воск для ПЦР	Твердое вещество белого цвета	1,7	1 пробирка	нет	нет
Минеральное масло для ПЦР	Вязкая прозрачная бесцветная жидкость	4,0	1 пробирка или капельни- ца	4,0	1 пробирка или капельни- ца
ПКО ДНК Treponema pallidum	Прозрачная бесцветная жидкость	0,2	1 пробирка	0,2	1 пробирка
ДНК-буфер	Прозрачная бесцветная жидкость	0,5	1 пробирка	0,5	1 пробирка

Комплект рассчитан на постановку 110 реакций, включая контрольные образцы.

Комплект № 3 "ЭФ-200" включает:

Реактив	Описание	Объем (мл) масса (г)	Кол-во
Трис-боратный буфер (ТБЕ) концентрированный с бромидом этидия	Прозрачная жидкость оранжевого цвета	50 мл	1 флакон
Агароза для электрофореза ДНК	Порошок белого цвета	1,7г	2 пробирки

Комплект рассчитан на электрофоретический анализ 240 образцов (из расчета 100 мл геля длиной в 5 рядов по 24 лунки).

ЗАБОР И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ.

Перед началом работы следует ознакомиться с "Методическими рекомендациями по взятию, транспортировке, хранению и пробоподготовке биологического материала для ПЦР- диагностики", разработанными ЦНИИЭ МЗ РФ (Москва, 2003).

Материалом для исследования служат: отделяемое из эрозивно-язвенных и высыпных элементов слизистых оболочек и кожи; мазки из цервикального канала и влагалища; соскоб из уретры (у мужчин). Забор клинического материала должен производиться в пробирки с прилагаемой транспортной средой. Недопустимо использование транспортной среды других фирм-производителей.

Забор материала из эрозивно-язвенных элементов слизистых оболочек и кожи производят стерильным одноразовым универсальным зондом вращающими движениями в течение 10-15 сек, после чего его помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой (0,3 мл). Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, вращают зонд в течение 10-15 сек, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.

Забор материала (соскоб из урогенитального тракта) у женщин.

Забор материала производят отдельными одноразовыми, стерильными зондами.

Забор материала из цервикального канала. Удаляют слизь с поверхности шейки матки тампоном, вводят зонд в цервикальный канал на 1-1,5 см и вращают его в течение 3-5 секунд. Извлекают зонд, избегая касания стенок влагалища, и помещают его в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой (0,3 мл). Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, вращают зонд в течение 10-15 секунд, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.

Забор материала из влагалища. В случае избытка слизи и обильных выделений удаляют их стерильным ватным тампоном. Проводят зондом по поверхности слизистой в области заднего свода влагалища и эктоцервикса и переносят зонд в пробирку с транспортной

средой (0,3 мл). Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, вращают зонд в течение 10-15 сек, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.

Забор материала (соскоб из урогенитального тракта) у мужчин.

Забор материала из уретры. Перед забором соскоба из уретры необходимо обработать головку полового члена в области наружного отверстия уретры тампоном, смоченным стерильным физраствором. Производят массаж уретры. При наличии свободно стекающих из уретры выделений удаляют их сухим тампоном. Вводят зонд в уретру на глубину 3-4 см. Несколькими вращательными движениями производят соскоб эпителиальных клеток и переносят зонд в пробирку с транспортной средой. Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, вращают зонд в течение 10-15 сек, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.

Предобработка вышеперечисленных проб материала не требуется. Допускается хранить пробы при комнатной температуре - в течение 6 ч; при температуре от 2 до 8 град. С - в течение 1 недели; при температуре минус 20 град. С - в течение 1 мес; при температуре минус 70 град. С - длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.

Необходимо строго соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы здравоохранения СССР", Москва, 1981 г.

1. Работать только в одноразовых перчатках, использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером. Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 0,2%-ный раствор ДП-2Т.

2. При работе с включенным трансиллюминатором пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской.

Анализ проводится в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах), согласно "Методическим рекомендациям по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции", утвержденным в 1995 году ГК СЭН.

3. Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными: запрещается переносить их из одного помещения в другое. Перемещение персонала из комнаты электрофореза в другие помещения должно проходить под строгим контролем. Смена верхней одежды,

головных уборов, обуви и перчаток является обязательным условием при выходе из помещения для электрофореза.

4. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ, ТРЕБУЕМЫЕ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-АНАЛИЗА

(с указанием фирм-производителей/поставщиков):

ЗОНА 1.

Для этапа выделения ДНК из клинического материала требуются:

1. Настольный бокс с бактерицидной лампой (например, "Циклотемп", фирмы СП "РТС", Россия) или стерильный ламинарный шкаф (например, БОВ-001-АМС, г. Миасс, Россия).

2. Термостат для пробирок типа "Эппендорф" на 25-100 град. С (например, "ТЕРМО-24", фирмы "Биоком", Россия).

3. Микроцентрифуга для пробирок типа "Эппендорф" до 16000 g (например, фирмы "Elmi", Латвия, фирмы "Hettish", Германия).

4. Центрифуга/вортекс (например "Micro-Spin", Германия, "ТЭТА-2", фирмы "Биоком", Россия).

5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, ОМ-1, г.Ульяновск, Россия).

6. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема (например, фирмы "Ленпипет", Россия).

7. Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки.

8. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл (например, фирмы "Axygen", США).

9. Штативы для микропробирок на 1,5 мл (например, фирмы "Хеликон", Россия) и наконечников (например, фирмы "Ленпипет", Россия).

10. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 мкл и до 1000 мкл (например, фирмы "Ленпипет", Россия).

11. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, фирмы "Axygen", США).

12. Холодильник на 2-8 град. С.

13. Ёмкость с дезинфицирующим раствором.

ЗОНА 2.

Для этапа амплификации ДНК (метод ПНР) требуются:

1. Амплификатор (например, "Терцик", фирмы "ДНК-технология", Россия; "GeneAmp PCR System 2400", "GeneAmp PCR System 2700", фирмы "Applied Biosystems", США; "Gradient Palm Cycler", фирмы "Corbett Research", Австралия).

2. ПЦР-бокс или отдельный стол, освещаемый УФ-лампой (например, "Циклотемп", фирмы СП "РТС", Россия).

3. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема (например, фирмы "Ленпипет", Россия).

4. Штативы для микропробирок на 0,5 мл (например, фирмы "Хеликон", Россия).

5. Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР на 0,5 или 0,2 мл (например, фирмы "Axygen", США).

6. Одноразовые наконечники для микропипеток в штативах (например, фирмы "Хеликон", Россия).

7. Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 200 мкл (например, фирмы "Axygen", США)

8. Холодильник на 2-8 град. С; морозильник на минус 20 град. С для хранения выделенной ДНК.

9. Термостат для микропробирок на 95 град. С (например, "ТЕРМО-24", фирмы "Биоком", Россия).

10. Отдельный халат и одноразовые перчатки.

11. Емкость для сброса наконечников.

ЗОНА 3.

Для электрофоретического анализа амплифицированнной ДНК требуются:

1. Камера для горизонтального электрофореза объёмом не более 400 мл (например, SE-2, фирмы "Хеликон", Россия).

2. Источник постоянного тока с напряжением 150-460 В (например, "Эльф-4", фирмы "ДНК-технология", Россия).

3. Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей (например, фирмы "Биоком", Россия).

4. Видеосистема с цифровой камерой для регистрации и передачи изображения (например, "Биотест-1", фирмы ФГУН "ЦНИИ эпидемиологии", Россия; "GelDoc", фирмы "BioRad", США)

5. Аквадистиллятор.

6. Холодильник на 2-8 град. С для хранения продуктов амплификации.

7. Микроволновая печь для плавления агарозы.

8. Колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы на 250 мл.

9. Мерный цилиндр на 1 л.

10. Штатив для микропробирок на 0,5 мл (например, фирмы "Хеликон", Россия).

11. Отдельная автоматическая пипетка объема 10-40 мкл (например, "Ленпипет", Россия).

12. Одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе (например, "Ленпипет", Россия).

13. Пластиковая ёмкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия.

14. Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.

ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

(проводится в ЗОНЕ 1 - помещении для обработки клинического материала).

Объем клинического материала для выделения ДНК - 0,1 мл.

1. Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 град. С) прогреть при температуре 60-65 град. С до полного растворения кристаллов.

2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок (включая отрицательный контроль выделения). Внести в каждую пробирку по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО комплексный) и по 300 мкл лизирующего раствора. Промаркировать пробирки.

3. В пробирки с лизирующим раствором и ВКО, внести по 100 мкл пробы, используя наконечники с аэрозольным барьером. В пробирку отрицательного контроля (ОК) выделения внести 100 мкл отрицательного контрольного образца (ОКО).

4. Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при температуре 65 град. С. Процентрифугировать 5 сек при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге. Если проба растворилась не полностью, процентрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс об/мин и использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.

5. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 20 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 2 мин, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 мин.

6. Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 30 сек. Удалить супернатант, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

7. Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировать 30 сек при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге. Удалить супернатант, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

8. Повторить отмывку еще раз, следуя пункту 7, удалить супернатант полностью.

9. Поместить пробирки в термостат при температуре 65 град. С на 5-10 мин для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

10. В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 65 град. С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

11. Процентрифугировать пробирки при 12 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Супернатант содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Очищенную ДНК можно хранить в течение 1 недели при температуре от 2 до 8 град. С и в течение 1 года - при температуре минус 20 град. С.

ЭТАП 2. АМПЛИФИКАЦИЯ УЧАСТКА ДНК (МЕТОД ПЦР)

(проводится в ЗОНЕ 2 - помещении для раскапывания реагентов и проведения ПЦР).

Общий объем реакции - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл

Проводится в ЗОНЕ 2 - комнате для подготовки и проведения ПЦР-амплификации.

Во всех комплектах для амплификации семейства "АмплиСенс" обязательно применяется "горячий старт", который обеспечивается разделением нуклеотидов и Taq-полимеразы прослойкой воска. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит только при температуре 95 град. С, что значительно снижает количество неспецифически затравленных реакций.

Подготовка пробирок для проведения ПЦР (при использовании комплекта "АмплиСенс 100-R" пункты 1 и 2 выполнять не нужно).

1. Пробирку с воском для ПЦР прогреть в термостате при температуре 95 град. С до полного расплавления воска.

2. Раскапать на дно микропробирок для амплификации по 5 мкл ПЦР-смеси-1 ("нижней"). Сверху добавить по капле (примерно 10-15 мкл) расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость. Пробирки с разлитой ПЦР-смесью-1 и воском можно хранить при температуре от 2 до 8 град. С.

3. Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1 и воском для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.

4. На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 ("верхней"), при этом ПЦР-смесь-2 не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1.

5. Сверху добавить по 1 капле масла для ПЦР (примерно 25 мкл).

Порядок работы.

1. Взять подготовленные для ПЦР пробирки. Под масло или непосредственно на масло, используя наконечники с аэрозольными барьерами, внести по 10 мкл ДНК, выделенной из клинических или контрольных проб этапа выделения ДНК.

2. Подготовить контрольные образцы этапа ПЦР:

а) отрицательный контроль (К-) - вместо ДНК-пробы внести в подготовленную пробирку 10 мкл ДНК-буфера;

б) положительный контроль (К+) - внести в пробирку 10 мкл положительного контрольного образца ПКО ДНК.

3. Запустить на амплификаторе нужную программу (см. таблицу 1).

Таблица 1. Программа для амплификации участка ДНК Treponema pallidum.

	Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке): "GeneAmp PCR System 2400" (Applied Biosystems), "Gradient Palm Cycler" (Corbett Research), "Терцик" (ДНК-технология)			Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке): "GeneAmp PCR System 2700" (Applied Biosystems)			Амплификаторы с матричным регулированием температуры: "Biometra", "MiniCycler", "РТС-100" (MJ Research)
цикл	темпера- тура	вре- мя	цик- лы	темпера- тура	вре- мя	циклы	темпера- тура	вре- мя	циклы
0	95 град. С	пауза		95 град. С	пауза		95 град. С	пауза
1	95 град. С	5 мин	1	95 град. С	5 мин	1	95 град. С	5 мин	1
2	95 град. С	10 с	42	95 град. С	15 c	42	95 град. С	1 мин	42
	65 град. С	10 с		65 град. С	25 c		65 град. С	1 мин
	72 град. С	10 с		72 град. С	25 c		72 град. С	1 мин
3	72 град. С	1 мин	1	72 град. С	1 мин	1	72 град. С	1 мин	1
4	4 град. С	хранение		4 град. С	хранение		10 град. С	хранение

4. Когда температура в ячейке амплификатора достигнет 95 град. С, поместить пробирки в ячейки амплификатора, закрыть крышку прибора и снять программу с паузы. Время амплификации на амплификаторе с регулированием температур по матрице примерно 2 ч 30 мин, на амплификаторе с активным регулированием - 1 ч 50 мин.

5. После окончания реакции собрать пробирки в специальный штатив и отправить в комнату для анализа продуктов ПЦР (ЗОНУ 3). Пробы после амплификации можно хранить 16 ч при комнатной температуре, в течение недели при температуре от 2 до 8 град. С (перед проведением электрофореза необходимо нагреть пробирки до комнатной температуры для размягчения воска).

Анализ продуктов амплификации проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле.

ЭТАП 3. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АМПЛИФИЦИРОВАННОЙ ДНК

(проводится в ЗОНЕ 3 - помещении для анализа продуктов амплификации).

ВНИМАНИЕ: РАБОТА С АМПЛИФИЦИРОВАННОЙ ДНК ДОЛЖНА ПРОВОДИТЬСЯ В ОТДЕЛЬНОЙ КОМНАТЕ СОТРУДНИКОМ ЛАБОРАТОРИИ, НЕ ПРОИЗВОДЯЩИМ МАНИПУЛЯЦИЙ В ЗОНЕ 1 И ЗОНЕ 2.

Приготовление рабочих растворов и агарозного геля.

1. Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл концентрированного ТБЕ, довести дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать.

ВНИМАНИЕ! Этидия бромид - канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним следует соблюдать правила безопасности: работать только в перчатках, избегать попадания на кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствующий участок водой.

Все реагенты, содержащие этидия бромид, перед утилизацией следует подвергать специальной обработке (см. раздел ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ).

2. Агарозу из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл готового рабочего буфера, перемешать вращением колбы и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы.

Время плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности 1 колбой - 1,5 мин. Если в микроволновую печь мощностью 800 Вт ставится 5 колб с агарозой, время плавления увеличивается до 5 мин. Вынуть колбу с расплавленной агарозой из микроволновой печи, аккуратно перемешать, вращая колбу. После этого вновь поместить колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 минуты (при мощности 800 Вт), довести агарозу до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и остудить агарозу, вращая колбу, до температуры 65-70 град. С.

3. Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры, установив гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга. Толщина геля должна быть около 6 мм.

4. После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынуть из него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к положительному. Залить в камеру готового буфера столько, чтобы он покрывал гель на 5 мм сверху.

Порядок работы.

1. Пробирки с продуктами амплификации последовательно выставить в штатив, отобрать из- под слоя масла по 10-15 мкл пробы и внести в лунки геля (если для нанесения разных проб используется один и тот же наконечник, то его необходимо промывать буфером из камеры после нанесения каждой пробы). В каждом ряду лунок геля должен быть обязательно представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс.

2. Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду), и включить источник. Если нет нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься пузырьки. Оптимальное напряжение электрического поля 10 В/см. При использовании камеры SE-2 ("Хеликон") и источника питания "Эльф-4" ("ДНК-технология") параметры источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза- 18-20 мин. 3. Когда краситель пройдет примерно половину длины геля (не менее 1,5 см), выключить источник тока, перенести гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получить изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отмечая порядок нанесения проб, занести в базу данных.

ВНИМАНИЕ! При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной!

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Учёт результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК (см. табл. 2 и рис.1).

Длина амплифицированных специфических фрагментов ДНК:

Treponema pallidum - 273 п.н.

Внутреннего контрольного образца - 668 п.н.

Таблица 2. Оценка результатов анализа контрольных точек.

Контроли	Какой этап ПЦР-анализа контролируется	Специфические полосы на электрофореграмме
		Полоса 273 п.н.	Полоса 668 п.н.
ОК	Выделение ДНК	Нет	Есть
К-	ПЦР	Нет	Нет
К+	ПЦР	Есть	Нет

1. В дорожке, соответствующей отрицательному контролю этапа выделения (ОК), должна быть только полоса внутреннего контроля на уровне 668 п.н.

2. В дорожке положительного контроля этапа ПЦР (К+) должна быть только полоса положительного контрольного образца - 273 п.н., и должна отсутствовать полоса внутреннего контрольного образца 668 п.н.

3. В дорожке, соответствующей отрицательному контролю этапа ПЦР (К-), не должно быть никаких полос, за исключением возможных праймер-димеров, находящихся ниже уровня 100 п.н.

4. Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу на уровне 273 п.н. большей или меньшей интенсивности независимо от наличия полосы внутреннего контрольного образца. Полоса внутреннего контрольного образца может отсутствовать в пробах с высокой концентрацией ДНК Treponema pallidum.

5. Отрицательными считаются образцы, которые содержат только полосу 668 п.н. большей или меньшей интенсивности и не содержат полосу 273 п.н.

6. Кроме полос 273 п.н. и 668 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые полосы праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 п.н.

Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях:

1. Если результаты анализа контрольных точек не совпадают с приведенными в таблице 2, то соответствующий этап анализа следует переделать.

2. Если в дорожке какой-либо из исследуемых проб отсутствуют обе полосы, и 273 п.н. и 668 п.н. Результат анализа по данной пробе считается недействительным, необходимо повторить исследование этой клинической пробы с самого начала. Возможная причина: ошибка в процедуре подготовки клинического материала, приведшая к потере ДНК или ингибированияю ПЦР.

3. В дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные причины: отсутствие "горячего старта" или неверный температурный режим в ячейках амплификатора.

4. Если в отрицательных контрольных образцах этапов выделения и ПЦР (OK, К-) выявляется специфическая полоса 273 п.н., это означает, что произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб с самого начала, а также принять меры по выявлению источника контаминации.

ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ.

1. Обезвреживание биоматериала и реагентов следует проводить на каждой стадии отдельно, помещая одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники), колбы-ловушки вакуумных отсасывателей на 20-24 ч в специальные контейнеры, содержащие дезинфицирующий 10%-ный раствор хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б, 0,2% раствор ДП-2Т.

2. Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата и затем 1 объем 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4-6 ч. Добавляют 1 объем 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию. Отработанный буфер можно дезактивировать с помощью стеклянной колонки емкостью на 1-2 л, заполненной активированным углем. Отработанный буфер пропускать через нее небольшими порциями. Дезактивированный раствор можно сливать в канализацию.

Срок годности:

6 месяцев. Тест-системы с истекшим сроком годности применению не подлежат.

Условия хранения:

В соответствии с СП 3.3.3.1248-03 в недоступном для детей месте; комплект № 1

(кроме транспортной среды для мазков, ВКО комплексного и ОКО) хранится при температуре от 2 до 25 град. С. Комплект № 2, транспортная среда для мазков, ВКО комплексный и ОКО хранятся при температуре от 2 до 8 град. С. Комплект № 3 хранится при температуре от 18 до 25 град. С в темном месте. При хранении тест-систему необходимо разукомплектовать!

Транспортирование. В соответствии с СП 3.3.3.1248-03; допускается транспортирование при температуре от 2 до 20 град. С в течение не более суток.

Дата актуализации инструкции 24.01.2014

Производитель: ЦНИИ эпидемиологии Федеральной службы Роспотребнадзора, Россия

Владелец регистрационного удостоверения: ЦНИИ эпидемиологии Федеральной службы Роспотребнадзора, Россия

Формы выпуска: набор диагностический многокомпонентный (1 комплект), упаковки комбинированные

Условия отпуска: для лечебно-профилактических учреждений

Данные гос. регистрации: ЛС-000916 от 18.11.2005

Состояние регистрационного удостоверения: окончание срока действия 18.11.2010

Номер фармстатьи: ФСП 42-0115-6242-05