Приложение А (рекомендуемое). Ферментативный метод определения изомеров молочной кислоты

Приложение А
(рекомендуемое)

Ферментативный метод определения изомеров молочной кислоты

Метод основан на окислении молочной кислоты (лактата) до пирувата коферментом в присутствии L-лактатдегидрогеназы (L-ЛДГ) или D-лактатдегидрогеназы (D-ЛДГ), смещении равновесия реакции в сторону образования пирувата и восстановленного путем преобразования пирувата в L-аланин под действием глутаматпируваттрансаминазы (ГПТ), фотометрическом определении концентрации образовавшегося , эквивалентной концентрации молочной кислоты в пробе.

А.1 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

Весы лабораторные с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более  мг по ГОСТ 24104.

Спектрофотометр диапазоном измерения, позволяющим проводить исследования при длине волны 340 нм, с допустимой погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%.

Кюветы фотометрические из оптического стекла или одноразовые полистироловые толщиной поглощающего свет слоя 1 см.

Шпатели пластмассовые или палочки стеклянные длиной от 10 до15 см.

Дозаторы пипеточные с одноразовыми пластмассовыми наконечниками объемом доз 0,02; 0,1; 0,2 и 1,0  или стеклянные микропипетки вместимостью от 0,1 до 0,5 .

Колба мерная 2-250-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 1-2-2-1, 1-2-2-10 по ГОСТ 29227.

Часы песочные на 5 мин.

Набор реактивов для определения D- и L-молочных кислот фирмы Boehringer Mannheim (номер по каталогу фирмы 1112821), включающий пять емкостей и рассчитанный приблизительно на 25 определений:

емкость 1 - 30  глицилглицинового буфера с рН 10,0. Содержит 440 мг L-глутаминовой кислоты;

емкость 2 - 210 мг лиофилизованного кофермента ;

емкость 3 - 0,7  суспензии фермента глутаматпируваттрансаминазы (ГПТ), 1100 единиц активности;

емкость 4 - 0,7  раствора фермента D-лактатдегидрогеназы (D-ЛДГ), 3800 единиц активности;

емкость 5 - 0,7  раствора фермента L-лактатдегидрогеназы (L-ЛДГ), 3800 единиц активности.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, по метрологическим характеристикам не уступающих перечисленным выше.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

А.2 Подготовка к испытанию

Раствор молочной кислоты готовят разбавлением, исходной молочной кислоты дистиллированной водой в 2500 раз (коэффициент разбавления F = 2500). Для этого в мерную колбу вместимостью 250  вносят 0,1  молочной кислоты, доводят объем раствора водой до метки, тщательно перемешивают.

Раствор кофермента . Перед использованием в емкость 2 добавляют 6  дистиллированной воды. Приготовленный раствор кофермента стабилен в течение трех недель при температуре плюс 4°С или двух месяцев при минус 20°С.

Растворы, вносимые в кюветы, должны иметь температуру °С.

А.3 Проведение испытания

Используют схему анализа, приведенную в методических рекомендациях фирмы Boehringer Mannheim [1].

Масса D- и L-молочных кислот в растворе, внесенном в кювету для фотометрирования, должна составлять от 0,3 до 20,0 мкг.

В фотометрические кюветы - контрольную и опытную пипеточными дозаторами вносят по 1  буферного раствора (емкость 1), по 0,2  раствора кофермента (емкость 2, после разбавления), по 0,02  суспензии фермента ГПТ (емкость 3). Затем в контрольную кювету вводят 1  дистиллированной воды, а в опытную - 0,1  разбавленного анализируемого раствора молочной кислоты и 0,9  дистиллированной воды.

Содержимое кювет перемешивают шпателями или стеклянными палочками, выдерживают 5 мин и сразу проводят измерение оптической плотности растворов в контрольной и опытной кюветах относительно воды при длине волны 340 нм.

Далее в эта же кюветы добавляют по 0,02  раствора D-ЛДГ (емкость 4), перемешивают, выдерживают содержимое кювет 30 мин при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность растворов в контрольной и опытной кюветах относительно воды при длине волны 340 нм для определения массовой доли D-молочной кислоты.

Затем в кюветы немедленно добавляют по 0,02  раствора L-ЛДГ (емкость 5), перемешивают и через 30 мин измеряют оптическую плотность растворов относительно воды для определения массовой доли L-молочной кислоты.

А.4 Обработка результатов

Разность значений оптических плотностей и находят по формулам:

, (А.1)

, (А.2)

где и - оптическая плотность растворов в контрольной (к) и опытной (оп) кюветах относительно воды после последовательного внесения в них растворов из емкостей 1, 2, 3 - , емкости 4 - , емкости 5 - .

Если значения и меньше 0,100 или больше 1,000, то раствор анализируемого образца готовят заново с меньшим или большим коэффициентом разбавления соответственно.

Массовые доли изомеров молочной кислоты , %, , %, и их сумму X, %, вычисляют по формулам:

; (А.3)

; (А.4)

, (А.5)

где - конечный объем раствора в кювете при определении D-молочной кислоты,  ;  ;

М - молярная масса D- и L-молочных кислот, ; М = 90,08 ;

F - коэффициент разбавления, рассчитываемый как отношение объема разбавленного раствора к объему молочной кислоты, взятому для разбавления;

- разность значений оптических плотностей при определении D-молочной кислоты, рассчитанная по формуле (А.1);

Е - коэффициент оптической плотности при длине волны 340 нм, ; E = 6,3 ;

d - толщина поглощающего свет слоя кюветы, см;

V - объем раствора молочной кислоты, израсходованный на разбавление, ;

- плотность раствора молочной кислоты, ;

- коэффициент пересчета содержания изомеров молочной кислоты в пробе на 100 г молочной кислоты;

- конечный объем раствора в кювете при определении L-молочной кислоты,  ;  ;

- разность значений оптических плотностей при определении L-молочной кислоты, рассчитанная по формуле (А.2).

Вычисления проводят с записью результата до второго десятичного знака.

За результат испытания принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений.

Предел повторяемости (сходимости) r - абсолютная разность результатов двух измерений, полученных в условиях повторяемости при доверительной вероятности Р = 95%, не превышает 0,6%.

Предел воспроизводимости R - абсолютная разность результатов двух измерений, полученных в условиях воспроизводимости при доверительной вероятности Р = 95%, не превышает 0,9%.

Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.