Приложение N 3. Инструкция по постановке серологических реакций на сифилис

Приложение N 3
к приказу Министра
здравоохранения СССР
N 86 от 27 февраля 1963 г.

Инструкция
по постановке серологических реакций на сифилис

Различная чувствительность и специфичность отдельных серореакций, обязывает для полноты выявления всех случаев сифилиса применять комплексное серологическое исследование. В комплекс реакций включается: реакция Борде-Вассермана и две осадочные реакции (Кана и Закса-Витебского).

Для разведения ингредиентов пользуются свежеприготовленным 0,85% раствором хлористого натра в дистиллированной воде (физиологический раствор). Необходимо употреблять химически чистый, лишенный примесей, препарат хлористого натра.

Реакция Борде-Вассермана ставится в объеме 2,5 мл (каждый ингредиент по 0,5 мл). Допускается выполнение реакции в объеме 1,25 мл (каждый ингредиент по 0,25 мл).

Гемолитическая сыворотка получается путем иммунизации кролика или осла эритроцитами барана. Хранение сыворотки производится на леднике.

Титр гемолитической сыворотки, применяемый для реакции, не должен быть ниже 1:1200. Определение титра производится по следующей схеме: приготавливается основное разведение 1:100 (0,1 мл гемолитической сыворотки + 9,9 физиологического раствора), из которого делают ряд необходимых разведений.

В ряд пробирок отмеривают по 0,5 мл приготовленных разведений гемолизина, начиная с 1:100, добавляют по 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов, 0,5 мл комплемента (сыворотки морской свинки в разведении 1:10) и 1,0 мл физиологического раствора по следующей схеме:

Таблица N 1

Схема разведений гемолизина

NN пробирок	Гемолизин		Физиологический раствор	Разведение гемолизина
I	0,1		9,9	1:100
II	0,5 1-го разведения		4,5	1:1000
III	0,5	"	5,5	1:1200
IV	0,5	"	7,0	1:1500
V	0,5	"	8,5	1:1800
VI	0,5	"	10,5	1:2100
VII	0,5	"	11,5	1:2400
VIII	0,5	"	13,0	1:2700
IX	0,5	"	14,5	1:3000
X	0,5	"	22,0	1:4500

Определение титра гемолизина

NN пробирок соответствен. табл. N 1	Гемолизин в соответственном разведении	Физиологический раствор	Комплемент 10%	Баранья кровь в виде 5% взвеси или 3% c осадка		Результат
I	-	-	-	-
II	0,5	1,0	0,5	0,5	В термостат на 1 час	Гемолиз
III	0,5	1,0	0,5	0,5		"
IV	0,5	1,0	0,5	0,5		"
V	0,5	1,0	0,5	0,5		"
						Задержка гемолиза
VI	0,5	1,0	0,5	0,5	Наблюдать ход гемолиза через 15-30-60 минут
VII	0,5	1,0	0,5	0,5		"
VIII	0,5	1,0	0,5	0,5		"
IX	0,5	1,0	0,5	0,5		"
X	0,5	1,0	0,5	0,5		"
Контрольная пробирка	0,5	1,5	-	0,5
	(1:1000)

Титром является наибольшее разведение гемолизина, давшее полное растворение эритроцитов. В данном случае титр гемолизина - 1:1500.

Для основного опыта и титрации ингредиентов берется разведение, усиленное против полученного титра в три раза (тройной титр). В данном примере - 1:500 (0,1 на 50).

Эритроциты барана

Эритроциты барана добываются пункцией яремной вены; кровь собирается в стерильную банку со стеклянными бусами, которая встряхивается в течение 5-10 минут. После фильтрации через марлю производится трехкратное отмывание физиологическим раствором при помощи центрифуги. Последняя порция промывной жидкости должна быть бесцветной. Центрифугировать надо 10 минут при 1,5 тысячах оборотов в минуту.

В реакцию употребляется 3% взвесь эритроцитов из осадка (на 1 мл осадка эритроцитов добавляется 33 мл физиологического раствора). При отсутствии центрифуги допускается применение неотмытой крови в виде 5% взвеси дефибринированной крови барана.

В леднике эритроциты сохраняются в течение 3-5 дней. Дольше сохраняется неотмытая кровь. Для консервирования эритроцитов рекомендуется к 100 мл дефибринированной крови барана прибавить 15 мл смеси, приготовленной по следующей прописи: глюкозы - 6,0 + борной кислоты 4,5 + 100 мл физиологического раствора; смесь кипятится на водяной бане 3 дня по 20 минут. При пользовании консервированными эритроцитами перед опытом их необходимо отмыть физиологическим раствором.

Для получения эритроцитов пользуются бараном не моложе одного года и не старше 5 лет. Овцы для этой цели не пригодны, так как их эритроциты менее стойкие.

Кровь у барана следует брать не чаще 1 раза в 10 дней, в количестве не более 200 мл.

Комплемент

Применяется смесь сыворотки крови, полученной пункцией сердца у 3-5 здоровых (небеременных) морских свинок накануне постановки реакции.

Исключается применение свинок, обработанных человеческим белком. Обращается внимание на надлежащий корм и содержание их. Кровь для лучшего свертывания помещается на полчаса в термостат при 37°С. После образования сгустка последний отделяется от стенок пробирки, которая помещается на ледник до следующего дня. Отсосанная прозрачная сыворотка служит комплементом. Активность комплемента на леднике сохраняется в течение 1-2 суток. Рекомендуется применение свежего, сухого или консервированного комплемента (добавление к свежей сыворотке свинки 4% сухой борной кислоты и 5% сернокислого натра, химически чистых) сохраняется 1-2 месяца.

Независимо от применения свежего, сухого или консервированного комплемента непосредственно перед постановкой реакции производится титрование комплемента.

Комплемент титруется обязательно: а) "без антигенов", т.е. в присутствии только гемолитической системы и б) со всеми антигенами, входящими в опыт; в) предварительный опыт ставить не обязательно.

Приготовляется основное разведение комплемента 1:10, которое разливается в ряд пробирок от 0,05 до 0,3 мл, в ряды для антигенов добавляется по 0,5 мл разведенного антигена. Объем жидкости в каждой пробирке доводится физиологическим раствором до 1,5 мл. Штативы с пробирками помещаются в термостат при 37°С на 45 минут.

Через 45 минут добавляется гемолитическая система по 1 мл в каждую пробирку; пробирки встряхиваются и помещаются на один час в термостат. Одновременно ставятся три контроля: а) 0,5 мл эритроцитов 3% + 2 мл физиологического раствора; б) 0,5 мл комплемента + 0,5 мл эритроцитов 3% + 1,5 мл физиологического раствора; в) 0,5 мл гемолизина, разведенного по титру, + 0,5 мл эритроцитов 3% + 1,5 мл физиологического раствора. Кроме того, для каждого антигена ставят контроль на гемотоксичность: 1,0 мл антигена, разведенного по титру + 1,0 мл физиологического раствора + 0,5 мл эритроцитов 3%.

Для сенсибилизации эритроцитов берут равные объемы гемолизина и эритроцитов из расчета по 0,5 мл для каждой пробирки: смешивание гемолизина и эритроцитов производить по возможности быстро, приливая гемолизин к взвеси эритроцитов, а не обратно. Выдерживать для сенсибилизации полчаса в термостате.

Титром комплемента является его минимальное количество, способствующее растворению добавленных сенсибилизированных эритроцитов. Для основного опыта необходима надбавка комплемента в пределах 20-30% к вытитрованной в присутствии антигена минимальной дозе в зависимости от степени гемолиза в последних пробирках с меньшим количеством комплемента и учетом свойства употребляемых антигенов.

Титрование комплемента без антигена (при объеме в 2,5 мл)

NN пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9	Контроль
										1	2	3
Ингредиенты
3% взвесь бараньих эритроцитов	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0,5	0,5	0,5
Гемолитическая сыворотка, разведенная по 3-кратному титру	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0,5	-
Комплемент 1:10	0,05	0,08	0,1	0,12	0,15	0,18	0,2	0,25	0,3	0,5	-	-
0,85% физраствор	1,45	1,42	1,4	1,38	1,35	1,32	1,3	1,25	1,2	1,5	1,5	2,0
	В термостат на 45 минут
Гемолитическая система (сенсибилизированная)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	-	-	-
	В термостат на 45 минут
Результат	-Г	-Г		+Г	+Г	+Г	+Г	+Г	+Г	-Г	-Г	-Г
	В данном случае ориентировочный титр компл. 0,12

Титрование комплемента в присутствии антигена

NN пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9	Контроль антигена
Ингредиенты
3% взвесь бараньих эритроцитов	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0,5
Комплемент 1:10	0,05	0,08	0,1	0,12	0,15	0,18	0,2	0,25	0,3	-
0,85% физраствора	0,95	0,92	0,9	0,88	0,85	0,82	0,8	0,75	0,7	1,0
Антиген, разведенный по титру	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	1,0
Гемолитическая система (сенсибилизированная)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	-
	В термостат на 45 минут
Результат	-Г	-Г	-Г		+Г	+Г	+Г	+Г	+Г
	В данном случае титр комплемента 0,15, а его рабочая доза 0,18, т.е. 3,6%

Обозначение: +Г = полный гемолиз; -Г = полная задержка гемолиза.

Предварительный опыт (ставить не обязательно)

После титрования комплемента "без антигена" можно производить титрование комплемента в присутствии сывороток. Пользуются сыворотками из постановки данного дня (доноры, больные различными заболеваниями, кроме сифилиса и др.) и положительными сыворотками из прошлого опыта (2+, 3+, 4+ в разведении 1:5) при условии их хранения на холоде (+5°) в течение 2-3 дней, но не более 5 дней. Следует учесть, что на этих слабо положительных сыворотках не всегда удается достигнуть результатов, тождественных с результатами прошлого опыта.

Предварительный опыт ставится по схеме основного опыта на 10 сыворотках, из которых 6-8 должны быть отрицательными. Пользуются одним хорошо выверенным антигеном и несколькими дозами комплемента. Первой испытуемой дозой комплемента является исходный литический титр с надбавкой 25-30%. Так при титре комплемента "без антигена" равном 2%, первой испытуемой дозой комплемента явится 2,5%, последующие дозы соответствуют 3%, 3,5% и 4%. Контроль сывороток ставится с первой или двумя первыми испытуемыми дозами комплемента.

Обе инкубации в термостате при 37°С в течение 45 минут. Учитывается та наименьшая доза комплемента, с которой получен полный гемолиз во всех или большинстве отрицательных сывороток.

Эта доза является рабочей дозой комплемента данного дня.

Титрование комплемента
(в объеме 1,25 мл в присутствии нормальной сыворотки)

При постановке реакции Вассермана в объеме 1,25 мл титрование комплемента следует также производить в объеме 1,25 мл.

Комплемент морской свинки разводят: 1:10, т.е. 1 мл комплемента + 9 мл физиологического раствора.

Отрицательная по реакции Вассермана и осадочным реакциям (нормальная) инактивированная сыворотка человека разводится 1:5, т.е. 2 мл сыворотки + 8 мл физиологического раствора.

Ставят четыре ряда пробирок, по 12 пробирок в ряд: три ряда для титрования комплемента в присутствии трех антигенов и четвертый ряд для титрования комплемента "без антигена".

Ставят также шесть контрольных пробирок: три для контроля антигенов на гемотоксичность и по одной для контроля комплемента, гемолизина и физиологического раствора на гемотоксичность. Контрольные пробирки заполняются до соединения бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки по следующей схеме:

Контроли

	I	II	III	IV	V	VI
3% взвесь бараньих эритроцитов	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Гемолитическая сыворотка, разведенная по 3-кратному титру	-	0,25	-	-	-	-
Физиологический раствор	0,75	0,75	1,0	0,5	0,5	0,5
Комплемент 1:10	0,25	-	-	-	-	-
Антиген кардиолипиновый, разведенный по титру	-	-	-	0,5	-	-
Антиген обычный неспецифический, разведенный по титру	-	-	-	-	0,5	-
Антиген трепонемальный, разведенный по титру	-	-	-	-	-	0,5
	В термостат на 45 минут
Результат	-Г	-Г	Г-	-Г	-Г	-Г

В первый ряд пробирок разливается комплемент, разведенный 1:10 в дозах: 0,1-0,16-0,18-0,2-0,22, 0,24-0,3-0,36-0,4-0,5-0,56, 0,6; в эти пробирки приливается физиологический раствор до одного мл, т.е. соответственно: 0,9-0,84, 0,82-0,8-0,78, 0,76-0,7-0,64-0,6-0,5-0,44-0,4. Смеси, полученные в каждой пробирке в количестве 1 мл, перемешивают и разливают по 0,25 мл, в соответственно стоящие позади три пробирки. Затем во все сорок восемь пробирок наливают по 0,25 мл разведенной 1:5 нормальной инактивированной сыворотки. Далее, в первый ряд наливают по 0,25 мл разведенного по титру антигена N 1, во второй ряд - антиген N 2, в третий ряд - антиген N 3. В четвертый ряд приливают вместо антигена по 0,25 мл физиологического раствора.

Штатив со всеми пробирками помещают на 45 минут в термостат, после чего приливают в каждую пробирку по 0,5 мл гемолитической системы. Штатив с пробирками вновь помещают в термостат на 45 минут.

Схема титрования комплемента в объеме 1,25 мл в присутствии антигена и нормальной сыворотки

NN пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Комплемент 1:10	0,1	0,16	0,18	0,2	0,22	0,24	0,3	0,36	0,4	0,5	0,56	0,6
Физраствор	0,9	0,84	0,82	0,8	0,78	0,76	0,7	0,64	0,6	0,5	0,44	0,4
	Из каждой пробирки с разведением комплемента наливают по 0,25 мл в соответственно стоящие позади три пробирки
Нормальная сыворотка 1:5	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Антиген, разведенный по титру	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
	В термостат на 45 минут
Гемолитическая система	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Результат	-Г	-Г	-Г		+Г	+Г	+Г	+Г	+Г	+Г	+Г	+Г
	В данном случае титр комплемент - 2,2%

Рабочей дозой комплемента является его наименьшая доза, дающая в присутствии антигена и нормальной сыворотки полный гемолиз + надбавка 15-20%, кроме трепонемального антигена, при пользовании которым надбавка к рабочей дозе комплемента не делается. Если полный гемолиз получен во II пробирке, рабочая доза комплемента будет равна 1,8%, если в III пробирке то - 2,0%, в IV - 2,2%, в V - 2,4%, в VI - 3,0%, в VII - 3,6%, в VIII - 4,0%, в IX - 5,0%, в X - 5,6%, в XI - 6,0%.

Наилучшим считается комплемент морской свинки. При отсутствии такового допускается пользование комплементом человека. Для этого сыворотки не менее 5 доноров, отрицательные по Вассерману и осадочным реакциям, не позднее 24 часов после взятия крови смешиваются и консервируются 2% сухой борной кислоты и 3% сухого сернокислого натра. Человеческий комплемент для титрования разводится 1 + 1 физиологическим раствором. Титрование комплемента и разведение остальных ингредиентов идет по обычной схеме. Надбавка для рабочей дозы 30-50%.

Можно пользоваться также сухим (лиофильным) комплементом. Сухой комплемент сохраняется в запаянных под вакуумом ампулах. В каждой ампуле высушено по 1,0 мл комплемента. Для титрования комплемента и постановки реакции Вассермана (100 сывороток) содержимое 4-5 ампул высыпают в сухую пробирку, после чего ампулы смывают 4-5 мл физиологического раствора: смывы сливают в пробирку с сухим комплементом. Титрование сухого комплемента проводится по схеме, принятой для нативного комплемента.

Антиген

Антигены для реакции Борде-Вассермана и осадочных реакций изготовляются централизованно и выписываются из крупных институтов.

В качестве антигенов применяются в большинстве случаев холестеринизированные спиртовые экстракты из мышц бычьего сердца.

Реакция Борде-Вассермана должна ставиться с тремя антигенами разных серий: 1) кардиолипиновый ЦКВИ, 2) трепонемальный озвученный или протеиновая фракция из трепонем, 3) обычный неспецифический.

Неспецифические антигены сохраняются в темноте при комнатной температуре (не ниже 15°) во флаконах под тугой корковой или хорошо притертой стеклянной пробкой. При выпадении кристаллов антигены ставятся в термостат или водяную баню при 50° для просветления. Трепонемальный антиген следует хранить при температуре +3°, +5°. Неспецифические антигены следует набирать сухой пипеткой. Для реакции антигены разводятся соответственно способу и титру, указанному на этикетке.

Титр - количество чистого антигена на 1 мл физиологического раствора (например, титр 0,005 на 1 мл); следовательно для разведения необходимо взять 0,05 на 10 мл или 0,1 мл на 20 мл физиологического раствора (рекомендуется разводить не менее 0,1 мл антигена).

В зависимости от указания на этикетке способ разведения может быть различен: а) в отмеренный объем физиологического раствора вводится необходимое количество антигена; б) к отмеренному объему антигена добавляется соответственное количество физиологического раствора; в) смешивание антигена с физиологическим раствором может быть быстрым и медленным. Разведенные по титру антигены вводятся в реакцию в количестве 0,5 мл при работе в объеме 2,5 мл.

Двойные дозы антигенов не должны обладать гемотоксичностью (гемолиз в отсутствии комплемента), что устанавливается соответствующим контролем антигена при титровании комплемента. Антигены не должны быть антикомплементарны (подавление гемолиза), что также устанавливается при титровании комплемента в присутствии антигенов.

Сыворотка больного

Для исследования необходимо 5-10 мл крови, полученной пункцией локтевой вены после наложения жгута при соблюдении асептических условий. Пункция производится одной стерильной иглой или иглой, надетой на стерильный шприц, промытый физиологическим раствором. У грудных детей кровь собирается из надреза на пятке.

Взятие крови производится натощак или не ранее четырех часов после приема пищи, не ранее 3 дней после медикаментозного лечения (наркотики, дигиталис и т.д.); нельзя брать кровь у лихорадящих и после употребления спиртных напитков. Собранная в стерильную пробирку кровь оставляется на один час при 37°С в термостате или на 2 часа при комнатной температуре. Затем образовавшийся сгусток отделяется от стенок пробирки платиновой петлей или стеклянной палочкой; кровь помещается в ледник до следующего дня. На другой день образовавшаяся сыворотка отсасывается пастеровской пипеткой с баллоном и помещается в водяную баню (55-56°С) на 30 минут (инактивация).

Инактивированные сыворотки могут храниться в леднике в течение 5-6 дней. В день постановки сыворотки прогревают вновь в течение 15 минут при 55-56°. Для более длительного сохранения к сыворотке после инактивации добавляют сухой борной кислоты (из расчета 2%), что позволяет ею пользоваться в течение 3-4 недель. Консервированная сыворотка транспортируется в запаянной ампуле.

Там, где нет возможности ставить серологические реакции, допускается пересылка высушенной сыворотки в лабораторию (см. инструкцию по высушиванию сывороток).

Основной опыт

Подготовительная работа (отмывание эритроцитов, инактивация сывороток больных) производится в день постановки. В день постановки также разводятся ингредиенты: эритроциты, гемолизин, антигены. Определяется "рабочая доза" комплемента титрованием по указанной схеме. Для главного опыта в четыре пробирки отмеривается по 0,1 мл инактивированной испытуемой сыворотки и по 0,4 мл физиологического раствора, за исключением четвертой пробирки, в которую вводится 0,9 мл физиологического раствора.

(При постановке реакции в объеме 1,25 мл сыворотку не следует разливать в четыре пробирки по 0,05 мл; надлежит в контрольную пробирку налить 0,8 мл физиологического раствора + 0,2 мл инактивированной испытуемой сыворотки. Полученная смесь разливается по 0,25 мл в три основных пробирки и в контрольной остается 0,25 мл).

В первую пробирку добавляют по 0,5 мл разведенного по титру антигена первого, во вторую - второго, в третью - третьего. Комплемент, разведенный в соответствии с рабочей дозой, прибавляется по 0,5 мл во все пробирки опыта. Допускается смешивание равных объемов разведенного по титру антигена и разведенного по рабочей дозе комплемента и одномоментная их разливка в соответствующие ряды.

После смешивания пробирки помещаются в термостат на 45 минут при 37°С. Затем добавляется во все пробирки гемолитическая смесь в объеме 1,0 мл; пробирки взбалтываются и помещаются в термостат до наступления гемолиза в контролях сыворотки.

Одновременно производится постановка контролей опыта: а) реакция с тремя заведомо отрицательными и тремя положительными (различной силы) сыворотками, оставшимися от предыдущей постановки или консервированных.

Оценка результатов реакции производится через 40-60 минут, когда наступает гемолиз в контролях. Пробирки с сомнительными результатами оставляются на леднике или в прохладном месте до следующего дня для повторной регистрации.

Отрицательный результат реакции характеризуется полным гемолизом во всех пробирках опыта. При положительном результате в первых трех пробирках с испытуемой сывороткой в присутствии антигена наблюдается более или менее сильно выраженная задержка гемолиза, в четвертой пробирке (контроль сыворотки), не содержащей антигена, - полный гемолиз. Степень задержки гемолиза отмечается числом крестов: 4+ = полная задержка гемолиза, 3+ = ясная задержка, 2+ = частичная задержка, + = слабая задержка.

Основной опыт реакции Вассермана (при объеме в 2,5 мл)

NN пробирок	1	2	3	4 контроль
Ингредиенты:
Инактивированная испытуемая сыворотка в мл	0,1	0,1	0,1	0,1
0,85% физиологический раствор в мл	0,4	0,4	0,4	0,9
Антиген кардиолипиновый, разведенный по титру в мл	0,5	-	-	-
Антиген обычный неспецифический, разведенный по титру в мл	-	0,5	-	-
Антиген трепонемальный, разведенный по титру в мл	-	-	0,5	-
Комплемент, разведенный согласно рабочей дозе в мл	0,5	0,5	0,5	0,5
	В термостат на 45 минут
Гемолитическая система (сенсибилизированная) в мл	1,0	1,0	1,0	1,0
	В термостат на 40-60 минут в зависимости от наступления гемолиза в контролях
Регистрация опыта после наступления гемолиза во всех контролях
Результат:
1) с сывороткой больного сифилисом:	-Г	-Г	-Г	+Г
2) с нормальной сывороткой	+Г	+Г	+Г	+Г

Обозначения: -Г = полная задержка гемолиза,

+Г = полный гемолиз

Оценка результатов производится в протоколе лаборатории. В письменных ответах, посылаемых лечащему врачу, результаты отмечаются следующим образом: положительный (4+ и 3+), слабо положительный (2+ и +), сомнительный и отрицательный (-).

Результаты реакции следует давать с каждым антигеном отдельно.

В случае резкого расхождения результатов одной сыворотки с различными антигенами необходимо повторное исследование новой порции сыворотки с тремя антигенами; повторное исследование необходимо также при наличии задержки гемолиза в контроле сыворотки (4-я пробирка не содержащая антигена).

Правильность течения главного опыта оценивается на основании следующих результатов: а) контроля сывороток - 4-й ряд пробирок (-); б) контроля с заведомо нормальной сывороткой (-); с заведомо положительной (3+ и 4+); с слабо положительной (+ и 2+); в) контроля антигенов на антикомплементарность (-); г) контроля антигенов на гемотоксичность (4+).

Количественный метод реакции Вассермана

Этот метод в отличие от обычного качественного состоит в определении титра люэс-реагинов испытуемой сыворотки. Он должен найти свое применение при изучении динамики РВ под влиянием новых антисифилитических средств и методов лечения, серорезистентного сифилиса, биологических ложных положительных реакций и т.д.

Среди нескольких количественных методов РВ наиболее простым по технике и чувствительности является метод постановки РВ с падающими дозами испытуемой инактивированной сыворотки. Сначала готовится основное разведение сыворотки 1:5; из него следующие (путем переноса из пробирки в пробирку) - 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и выше. В остальном - обычная методика РВ; применяется один хороший выверенный антиген. В выдаваемых лабораторией анализах при наличии положительной реакции указывается, с каким титром испытуемой сыворотки получена положительная реакция.

Реакция Вассермана со спинномозговой жидкостью

Мутная или с примесью крови жидкость центрифугируется и отсасывается с осадка. Реакция ставится с непрогретой жидкостью. Спинномозговая жидкость параллельно исследуется в трех дозах а) неразведенная; б) разведенная физиологическим раствором 1+1; в) разведенная 1+4. Реакция производится параллельно с каждым разведением по обычной схеме. Ввиду отсутствия антикомплементарных свойств спинномозговой жидкости для ее исследования комплемент в реакцию вводится по титру (первая растворяющая доза) без обычной надбавки.

В ответе результаты опыта отмечаются отдельно для каждой дозы.

Схема основного опыта РВ со спинномозговой жидкостью

NN пробирок	Спинномозговая жидкость	Физиологический раствор	Антиген	Комплемент по титру без надбавки		Гемолитическая система		Учет результатов
1	0,1	0,4	0,5	0,5	Термостат при 37°С 45 мин	1,0	Термостат при 37°С	Через 40-60 мин в зависимости от гемолиза в контроле
2	0,1	0,4	0,5	0,5		1,0
3	0,1	0,4	0,5	0,5		1,0
4	0,25	0,25	0,5	0,5		1,0
5	0,25	0,25	0,5	0,5		1,0
6	0,25	0,25	0,5	0,5		1,0
7	0,5	-	0,5	0,5		1,0
8	0,5	-	0,5	0,5		1,0
9	0,5	-	0,5	0,5		1,0
10	0,5	0,5	-	0,5		1,0

Осадочные реакции

Реакция Кана. Для реакции необходимы инактивированная испытуемая сыворотка и антиген Кана.

Антиген разводится по титру, указанному на этикетке, на каждый 1 мл антигена добавляется 1 мл, 1,1 мл, 1,2 мл и т.д. физиологического раствора. Для приготовления разведения антигена в одну пробирку отмеривают необходимое количество физиологического раствора, в другую - антигена; физиологический раствор быстро вливается в антиген и смесь переливается из пробирки в пробирку 6-7 раз, после чего разведение оставляется на 10 минут при комнатной температуре (созревание). Созревшая антигенная эмульсия пригодна в течение не более 10-15 минут.

Каждая сыворотка исследуется не в трех пробирках, как предложил Кан, а в одной пробирке. При помощи микропипетки, опущенной на дно пробирки, вносится 0,025 мл разведенного антигена и по 0,15 мл инактивированной сыворотки. В контрольную пробирку (контроль антигена) вносится та же доза антигена, причем вместо сыворотки вводят 0,15 мл физиологического раствора. После 3-минутного встряхивания добавляется 0,5 мл физиологического раствора. Для всего опыта ставят одну контрольную пробирку. Смесь в контрольной пробирке не должна давать образования преципитата.

Схема постановки реакции Кана

NN пробирок	1 опыт	2 контроль антигена
Ингредиенты
Антиген, разведенный по титру в мл	0,025	0,025
Сыворотка в мл	0,15	-
Физраствор в мл	-	0,15
Встряхивать три минуты
Физраствор в мл	0,5	0,5
Встряхивать для смешивания

Учет результатов. После добавления физиологического раствора производится чтение результата невооруженным глазом, или при помощи лупы, или агглютиноскопа.

Образование ясного преципитата "хлопьев" отмечается как положительный результат реакции, более слабое образование преципитата - как слабоположительный, и отсутствием преципитата, как отрицательный результат реакции.

Реакция Закс-Витебского (Цитохоль). Для реакции необходимы инактивированная испытуемая сыворотка и антиген*, приготовленный по прописи Закс-Витебского. Для разведения одна часть антигена быстро приливается к двум-трем частям физиологического раствора (согласно титру, указанному на этикетке), смешивается и оставляется на 10 минут при комнатной температуре до появления крупных хлопьев (созревание). Для реакции в пробирку отмеривается 0,1 мл инактивированной сыворотки, 0,05 мл разведенного антигена, смесь встряхивается 3 минуты, оставляется на 30 минут при комнатной температуре, после чего добавляется 0,5 мл физиологического раствора и снова встряхивается. Параллельно ставится контроль антигена, в который вместо сыворотки вводится 0,1 мл физиологического раствора.

Схема реакции Закс-Витебского (Цитохоль)

NN пробирок	1 опыт	2 контроль антигена
Сыворотка в мл	0,1	-
Антиген, разведенный по титру в мл	0,05	0,05
Физраствор в мл	-	0,1
Встряхивать три минуты. Оставить на 30 минут при комнатной температуре.
Физраствор в мл	0,5	0,5
Встряхивать 5-10 секунд

Учет результатов. Учет результатов производится после добавления физиологического раствора, невооруженным глазом или в агглютиноскопе, как в реакции Кана.

Активные модификации

В случаях невозможности выполнения реакции Борде-Вассермана в условиях периферии (недостаточно оборудованные лаборатории, экспедиции и пр.) допускается постановка одной из активных модификаций (Григорьева-Раппопорта, Вайнштейна-Резниковой) при условии применения двух осадочных реакций.

Реакция Григорьева-Раппопорта основана на использовании в реакции комплемента испытуемой сыворотки. Для реакции необходимо пользоваться свежей (не раньше 8 и не позднее 36 часов после взятия) активной непрогретой сывороткой больного. Кроме того, необходимы вассермановские антигены, гемолитическая сыворотка и дефибринированная (но не отмытая) и профильтрованная через 2 слоя марли кровь барана. Гемолитическая сыворотка разводится по усиленному в 4 раза титру (т.е. если титр 1:1200, разводят 1:300). Взвесь эритроцитов приготовляется следующим образом: к 24 мл физиологического раствора добавляется 1 мл дефибринированной бараньей крови. Для получения гемолитической системы соединяются равные объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов; после этого смесь оставляется при комнатной температуре (22°С) на 20 минут (сенсибилизация). Антигены разводятся как и для реакции Вассермана по титру и способу, указанным на этикетке.

Для постановки реакции в 3 пробирки отмеривается по 0,2 мл активной сыворотки; в первые две пробирки добавляют по 0,5 мл, а в третью контрольную 0,8 мл физиологического раствора.

В первую пробирку наливают 0,3 мл антигена первой серии, а во вторую пробирку - второй серии. Штатив с пробирками встряхивают и оставляют при комнатной температуре (22°С) на 20-25 минут. За это время штатив 1-2 раза встряхивают. Затем во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы. Пробирки встряхивают и помещают в термостат или водяную баню с температурой 22-25° (не свыше 30°) или оставляют при комнатной температуре на 25 минут или дольше до появления полного гемолиза в контрольной (третьей) пробирке, не содержащей антигена. В случае отсутствия гемолиза в контрольной пробирке реакция повторяется снова, причем к 0,2 мл исследуемой сыворотки добавляется 0,2 мл заведомо активной отрицательной сыворотки и соответственно уменьшается количество физиологического раствора.

Результат опыта учитывается немедленно по окончании реакции: положительный результат - полная задержка гемолиза; отрицательный - полный гемолиз. Результат определяют на основании двух первых пробирок, содержащих антиген.

Схема реакции Григорьева-Раппопорта

NN пробирок	1	2	3
Ингредиенты в мл
Активная сыворотка	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	0,5	0,5	0,8
Антиген первой серии	0,3	-	-
Антиген второй серии	-	0,3	-
Встряхивание Комнатная температура 25 минут
Гемолитическая система	1,0	1,0	1,0
Встряхивание Комнатная температура 25 минут Учет результатов

Активная модификация Вайнштейна-Резниковой. Особенности модификации: а) использование естественного комплемента и гемолизина испытуемой активной сыворотки; б) использование неотмытой дефибринированной бараньей крови; в) постановка реакции при комнатной температуре.

Подготовка ингредиентов: а) антиген - любой из применяемых в реакции Вассермана в концентрации в 3 раза крепче указанного титра; например, при титре 0,002 на 1 мл берут 0,006; антиген разводится физиологическим раствором по способу, указанному на этикетке; антиген должен быть не мутным, не прозрачным, а опалесцирующим; б) испытуемая активная сыворотка; реакция должна производиться не раньше 8 и не позднее 24 часов после взятия крови; в) баранья кровь: из цельной дефибринированной профильтрованной неотмытой бараньей крови готовят 1% взвесь (например, на 20 мл физиологического раствора берут 0,2 мл дефибринированной бараньей крови; г) физиологический раствор (0,85%), приготовленный в день постановки реакции или накануне.

Реакция ставится в трех пробирках при работе с двумя антигенами. Во все пробирки наливается по 0,2 мл испытуемой активной сыворотки. Затем в третью (контрольную) пробирку приливается 0,3 мл физиологического раствора, а в первую и вторую пробирки (основные) по 0,3 мл разведенных антигенов. Все пробирки тщательно встряхиваются в течение 3 минут, после чего во все пробирки приливают по 0,75 мл 1% дефибринированной бараньей крови; смеси вновь взбалтывают и оставляют на 45-60 минут при температуре 24-26°С.

Схема реакции Вайнштейна-Резниковой

NN пробирок	1	2	3
Ингредиенты в мл
Активная сыворотка	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	-	-	0,3
Антиген первой серии	0,3	-	-
Антиген второй серии	-	0,3	-
Встряхивать три минуты
1% взвесь дефибринированной бараньей крови	0,75	0,75	0,75
Встряхивание Оставить на 45-60 минут при температуре 24-26°

Регистрация опыта производится по наступлении гемолиза в контрольных пробирках.

Оценка результата реакции в основных пробирках дается по трем градациям: резко положительная 4+ (полная задержка гемолиза), слабо положительная 2+ (частичная задержка гемолиза), отрицательная (полный гемолиз). Существует небольшой процент сывороток без комплемента и гемолизина. Такие сыворотки дают задержку гемолиза в контроле. Сыворотки, давшие в контрольной пробирке задержку гемолиза, подлежат повторному исследованию: в три пробирки к 0,2 мл активной испытуемой сыворотки наливается по 0,1 мл "нормальной сыворотки", т.е. другой любой активной сыворотки, давшей в этот день отрицательный результат (добавление "нормальной" сыворотки восполняет недостающий комплемент и гемолизин в испытуемой сыворотке); затем повторяется вся реакция (прибавление в основные пробирки антигена, в контрольную - физиологического раствора, встряхивание, добавление бараньей крови и т.п.).

(Инструкция составлена микробиологическим отделом Центрального кожно-венерологического института и обсуждена на совещании заведующих серологическими лабораториями республиканских, краевых и областных кожно-венерологических диспансеров и институтов 13 апреля 1962 г.).

______________________________

* Антигены для р. Кана и Цитохолевой следует хранить под тугой корковой пробкой при температуре +15°, +18°.