Приложение 3. Методика определения нитритов и нитратов в кормах, овощах, бахчевых культурах, крови, патологическом материале, молоке и молочных продуктах

Приложение 3

Методика
определения нитритов и нитратов в кормах, овощах, бахчевых культурах, крови, патологическом материале, молоке и молочных продуктах

1. Принцип метода.

Метод определения нитритов основан на фотометрическом измерении интенсивности окраски азо-соединения розово-малинового цвета, образующегося при реакции нитритов с альфа-нафтиламином и сульфаниловой кислотой (реактив Грисса) в кислой среде после водного извлечения их из исследуемых проб.

Реакция специфична для нитритов.

Метод определения основан на водном извлечении их из исследуемых проб, количественном восстановлении нитратов в нитриты и последующем определении нитритов с реактивом Грисса.

2. Метрологическая характеристика метода

Предел определения нитритов составляет 0,05 мг/кг, мг/л, степень определения нитритов -

Предел определения нитратов -

3. Реактивы и растворы

Сульфаниловая кислота, ч.д.а. ГОСТ 5821-69

Альфа-нафтиламин, .ч.д.а. ГОСТ 8827-57'

Барий сернокислый., ч.д.а. ГОСТ 3158-75

Цинковая пыль, порошок цинка

Лимонная кислота, х.ч. или ч.д.а. ГОСТ 3652-69

Марганец сернокислый, ч.д.а. ГОСТ 435-67

Натрий азотистокислый , - х.ч. ГОСТ 4197-66

Калий азотнокислый , х.ч. ГОСТ 4217-65

Сульфаминовая кислота, х.ч. ТУ 6-09-2437-79 или ТУ 6-09-2437-79

Уксусная кислота, концентрированная (ледяная) ГОСТ 61-69

12%-ный: водный раствор уксусной кислоты

1%-ный водный раствор сульфаминовой кислоты

Уголь активированный марки "Б" или уголь активированный в таблетках (аптечный)

Натрий гидроокись, х.ч., ГОСТ 4328-77

Цинк сернокислый, ч.д.а. ГОСТ 4374-77

Приготовление реактива Грисса

а) 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 12%-ного раствора уксусной кислоты;

б) 0,1 г альфа-нафтиламина растворяют (при нагревании) в 20 мл дистиллированной воды, фильтруют и смешивают со 150 мл 12%-ного раствора уксусной кислоты.

Перед употреблением одну часть раствора "а" смешивают с равной по объему частью раствора "б".

Растворы "а" и "б" хранят отдельно в холодильнике, при необходимости - в течение полгода.

Приготовление стандартного раствора нитрита натрия

0,15 г высушенного до постоянного веса при температуре 80°С растворяют в 1 л дистиллированной воды, свободной от нитритов.

1 мл этого раствора содержит 0,100 мг (100 мгк) . Раствор хранят в холодильнике, он устойчив в течение месяца.

Приготовление рабочего раствора нитрита натрия

25 мл полученного стандартного раствора переносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор должен быть свежеприготовленным, 1 мл его содержит 0,0050 мг (5 мгк) . Этот раствор используют для построения калибровочной кривой.

Приготовление стандартного раствора нитрата калия

Растворяют 1,630 г нитрата калия, высушенного до постоянного веса при 105°С, в дистиллированной воде в мерной колбе на 1 л и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

1 мл этого раствора содержит 1 мг нитрат-ионов (). Раствор можно хранить в холодильнике в течение трех месяцев.

Приготовление рабочего раствора нитрата калия

В мерную колбу на 100 мл переносят пипеткой 1 мл стандартного раствора нитрата калия и доводят объем раствора в колбе до метки 12%-ным раствором уксусной кислоты.

1 мл этого раствора содержит 0,010 мг (10 мгк) . Раствор должен быть свежеприготовленным. Этот раствор используют для построения калибровочной кривой.

Приготовление реактива для восстановления нитратов в нитриты

а) барий сернокислый (высушенный при 100°С до постоянного веса) - 100 г

б) марганец сернокислый (прокаленный при 200°С в течение часа - 10,0 г

в) цинковая пыль - 2 г

г) лимонная кислота - 75,0 г

д) сульфаниловая кислота - 4,0 г

е) альфа-нафтиламин - 2,0 г

Каждый реактив тщательно растирают в ступке, затем к реактиву "а" в ступке последовательно добавляют реактивы "б", "в", "д", "е", "г" и тщательно перемешивают до получения однообразной массы.

Полученный реактив хранят в склянке из темного стекла, он пригоден для использования в течение двух лет.

Приготовление 12%-ного раствора уксусной кислоты

120 мл ледяной уксусной кислоты смешивают с 880 мл дистиллированной воды.

Приготовление 1%-ного раствора сульфаминовой кислоты

1 г сульфаминовой кислоты растворяют в 99 мл дистиллированной воды.

Приготовление 0,5 М раствора гидроокиси натрия

20 г NaOH растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят объем в колбе до метки дистиллированной водой.

Приготовление 5%-ного раствора сульфата цинка

5 г сульфата цинка растворяют в 95 мл дистиллированной воды.

4. Приборы и посуда

Химические пробирки

Пробирки с притертыми пробками

Центрифужные пробирки

Пипетки на 1, 5, 10, 20 мл

Мерные колбы на 100 и 1000 мл

Конические колбы на 100, 250 мл

Химические стаканы на 100, 200 мл

Мешочки для диализа или пленка для диализа N 3 (выпускается картонажными фабриками)

Цилиндры на 10, 50 и 100 мл

Химические воронки

Песочные часы на 2 минуты

Фотоэлектроколориметр

Центрифуга на 5000-6000 об/мин

Фильтры обеззоленные среднепористые

Пленку или мешочки для диализа перед использованием для анализа помещают на 30-40 минут в дистиллированную воду. Во всех случаях при проведении диализа пленку следует брать с запасом по отношению к пробе так, чтобы узел мешочка при проведении диализа не был опущен в воду.

5. Построение калибровочных кривых

Калибровочная кривая для определения нитритов

В 11 химических пробирок наливают рабочий раствор нитрита натрия в количествах, указанных в таблице. Затем в пробирки наливают дистиллированную воду до объема 10 мл, приливают по 1 мл реактива Грисса и энергично встряхивают.

Таблица для приготовления шкалы стандартов на нитриты

N пробирок	К-во рабочего раствора, мл	Содержание		N пробирок	К-во рабочего раствора, мл	Содержание
		мг	мкг			мг	мкг
1	0,1	0,0005	0,5	7	1,2	0,006	6,0
2	0,2	0,0010	1,0	8	1,4	0,007	7,0
3	0,4	0,0020	2,0	9	1,6	0,008	8,0
4	0,6	0,0030	3,0	10	1,8	0,009	9,0
5	0,8	0,0040	4,0	11	2,0	0,010	10,0
6	1,0	0,0050	5,0

Для построения калибровочной кривой через 15 минут после начала окрашивания определяют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм), кюветы - 10 мм, раствор для сравнения - дистиллированная вода.

Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрит-ионов (мкг), а на оси ординат - найденные значения оптической плотности растворов и проводят кривую через точки пересечения.

Эта же шкала стандартов может быть использована для визуального сравнения с опытными пробами.

Калибровочная кривая для определения нитратов

Для приготовления шкалы стандартов в 7 химических пробирок с притертыми пробками или в 7 центрифужных пробирок с притертыми пробками последовательно прибавляют по 0,3 г реактива для восстановления нитратов, затем приливают рабочий раствор и 12%-ную уксусную кислоту в количествах, указанных в таблице (общий объем составляет 10 мл).

Таблица для приготовления шкалы стандартов на нитраты

N пробирок	К-во рабочего раствора, мл	Содержание		Кол-во 12%-ной уксусной кислоты, мл
		мг	мкг
1	0,0	0,0		10,0
2	1,0	0,010	10	9,0
3	2,0	0,020	20	8,0
4	4,0	0,040	40	6,0
5	6,0	0,060	60	4,0
6	8,0	0,080	80	2,0
7	0,0	0,100	100	0,0

Затем пробирки или центрифужные пробирки, закрывают пробками и энергично встряхивают в течение ровно двух минут. Через 10 минут пробы центрифугируют в центрифужных пробирках при 5-6 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Далее проводят колориметрическое определение интенсивности окраски раствора при длине волны 540 нм, кюветы 10 мм, раствор для сравнения - 12%-ный раствор уксусной кислоты, обработанный как пробы сухим восстановителем и прошедший центрифугирование (пробирка N 1).

Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрат-ионов (мкг), а на оси ординат - найденные значения оптической плотности растворов и проводят кривую через точки пересечения.

Эта же школа стандартов может быть использована для визуальных определений.

6. Ход определения

Корма

Для исследования измельчают пробу кормов и берут навеску 2 - 10 грамм. Извлечение нитритов и нитратов из проб кормов проводят методом диализа. Для этого точно отмеривают 50 - 100 мл дистиллированной воды и используют этот объем для всех дальнейших операций с пробой. Пробу помещают в мешочек или пленку для диализа, приливают туда небольшое количество дистиллированной воды из первоначального объема (50 или 100 мл). Воды приливают столько, чтобы она хорошо смочила пробу. Далее пленку завязывают в виде мешочка, весь оставшийся объем дистиллированной воды (от 50 или 100 мл) наливают в химический стаканчик, опускают мешочек в стакан таким образом, чтобы полностью погрузить пробу в воду и оставляют пробу для проведения диализа в течение 1,5 - 2 часов.

Затем, не вынимая мешочков из стаканов, пипеткой отбирают 10 мл диализата для анализа на нитриты и 5 мл - для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано ниже.

Кровь, органы и ткани животных

Для анализа берут 20 - 50 мл крови, 2 - 10 г органов или тканей животных, помещают пробу в диализный мешочек и опускают в химический стаканчик, в который наливают соответственно 50 - 100 мл прокипяченной горячей дистиллированной воды. Через 1,5 - 2 часа пипеткой отбирают из стаканчика 10 мл диализата для анализа на нитриты и 5 мл - для анализа на нитраты и проводят анализ как описано ниже.

Если раствор в стакане после диализа имеет окраску или муть, такой раствор следует анализировать после удаления пигментов или мути.

Пигменты, окрашивающие диализат, удаляют путем фильтрования небольшого объема диализата через воронку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 активированным углем. Уголь на фильтре предварительно промывают 50 мл прокипяченной дистиллированной воды, которую отбрасывают. Затем через этот фильтр отфильтровывают объем диализата, необходимый для анализа на нитриты и нитраты. В случае необходимо проводят повторное фильтрование этого раствора через свежую порцию активированного угля, промытого водой, до полного исчезновения окраски диализата.

При наличии в диализате мути проводят осаждение белков смесью 0,5 М раствора NaOH 5%-ного раствора сульфата цинка в объемном отношении 2:5. Для этого отбирают из стакана 30 мл диализата, переносят его в другой стаканчик или колбу, добавляют 10 - 20 мл вышеуказанной смеси. После выпадения осадка диализат фильтруют, измеряют объем фильтрата и отбирают 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты.

В этом случае при расчете по формуле содержания нитратов и нитритов за общий объем фильтрата следует принимать сумму объема диализата, оставшегося в первом стаканчике (20 мл) и объема фильтрата, измеренного после осаждения белков и фильтрования.

Молоко, молозиво, обрат, сухое молоко, заменитель цельного молока (ЗЦМ)

Молоко, молозиво

Отбирают 20 - 50 мл молока или молозива, переносят в пленку для диализа и приливают туда 2 - 4 мл 12%-ной уксусной кислоты, перемешивают содержимое стеклянной палочкой, завязывают пленку и опускают ее в стакан, содержащий 50 - 100 мл горячей прокипяченной дистиллированной воды. Затем через 1,5 - 2 часа отбирают 5 мл диализата для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты и проводят анализ как описано ниже. В том случае, если в растворе после диализа есть муть, необходимо провести осаждение белков. Для этого отбирают 20 - 30 мл диализата, добавляют 10 - 20 мл смеси 0,5 М раствора NaOH и 5%-ного раствора сульфата цинка в объемном отношении 2:5. После выпадения осадка диализат фильтруют, измеряют объем фильтрата и отбирают пипеткой 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты.

Общий объем диализата при этом будет составлять сумму первоначального объема диализата, оставшегося в первом стакане, и измеренного после фильтрования объема.

Сухое молоко, ЗЦМ

Для анализа берут 2 - 5 г пробы, помещают в пленку для диализа, хорошо смачивают пробу небольшим объемом дистиллированной воды, приливают туда 2 - 4 мл 12%-ной уксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой, завязывают пленку и опускают ее в стакан, содержащий 50 - 100 мл горячей дистиллированной воды, диализ проводят в течение 1,5 - 2 часов. При расчета общего объема воды необходимо учесть объем воды, взятый для смачивания пробы.

Анализ проводят как описано для проб молока.

Обрат

Для анализа берут 20 - 50 мл обрата, приливают к нему 20 - 50 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивают в течение 10 минут и отбирают 5 мл анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты. Если в растворе есть муть или опалесценция необходимо проводить осаждение белков как указано выше.

Картофель, сахарная свекла, огурцы, капуста, лук, редька и др. овощи и бахчевые культуры, дающие с водой неокрашенные растворы.

После измельчения проб берут навеску 2 - 10 г, помещают в колбу и заливают 50 - 100 мл дистиллированной воды. Перемешивают в течение 1 - 15 минут и отбирают аликвотные количества для анализа на нитраты и нитриты. В том случае, если раствор имеет окраску, проводят фильтрование небольшого объема экстракта через активированный уголь, как описано выше.

7. Проведение определения

После того, как в пробирку отобрано 10 мл диализата для анализа на нитраты, туда добавляют 1 мл реактива Грисса (раствор "а" смешивают с раствором "б" в равных объемных частях), встряхивают содержимое пробирка и через 15 минут после появления окраски проводят измерение оптической плотности раствора на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм) против дистиллированной воды в кюветах с рабочей длиной 10 мм.

Для анализа на нитраты отбирают 5 мл диализата в пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно насыпано 0,3 г сухого восстановителя, приливают туда же 5 мл 12%-ной уксусной кислоты, закрывают пробирку пробкой и энергично встряхивают ее в течение точно двух минут.

В параллельную пробирку насыпают 0,3 г сухого восстановителя и заливают 10 мл 12%-ной уксусной кислоты, закрывают ее пробкой и встряхивают в течение двух минут (пробирка для сравнения) при измерении оптической плотности пробы.

Через 10 минут переливают содержимое пробирок в центрифужные пробирки и центрифугируют при 5-6 тыс. об/мин в течение 5 минут.

После этого проводят колориметрирование проб на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм, кюветы с рабочей длиной 10 мм). В качестве раствора для сравнения используют "холостой" раствор - раствор уксусной кислоты, обработанный сухим восстановителем, как описано выше.

В том случае, если в пробах устанавливается наличие большого содержания нитритов, свыше 20 мкг, (интенсивная окраска в пробирке), их следует удалять, т.к. они несколько завышают результаты определения нитратов.

Для деления нитритов к диализату в стакане, соответственно 50 или 100 мл, прибавляют 2 - 4 мл 1%-ного раствора сульфаминовой кислоты, перемешивают раствор стеклянной палочкой и оставляют на 5 минут. После этого отбирают 5 мл диализата для анализа на нитраты и проводят анализ как описано выше. При расчетах учитывают увеличение общего объема пробы.

После колориметрирования проб по соответствующим калибровочным кривым находят количество нитритов и нитратов, подставляют их в формулу для расчета (в мкг) и определяют содержание нитратов и нитритов.

Если при определении нитратов образуется очень интенсивная окраска, не укладывающаяся при определении оптической плотности в пределы калибровочной кривой, необходимо повторить определение, взяв меньшее аликвотное количество диализата для анализа, например, 0,1 мл и довести анализируемый объем до 10 мл 12%-ной уксусной кислотой. Далее провести анализ как указано выше, учитывая при расчетах разведение этого раствора.

ОДнако, если определяется очень высокое содержание нитратов (г/кг), необходимо повторить анализ данной пробы, соответственно уменьшая навеску и увеличивая объем дистиллированной воды для диализа. Можно также после проведения диализа в первый раз и установления высокого содержания нитратов, прибавить в стакан к прежнему диализату, в котором находится мешочек с пробой, еще 100 мл дистиллированной воды и провести дополнительный диализ в течение часа. После этого взять аликвотное количество для анализа и провести анализ на нитраты. При расчетах необходимо учесть это разведение диализата, в данном случае в 2 раза, т.е. общий объем диализата при этом составил не 100, а 200 мл.

8. Расчет результатов анализа

Расчет результатов анализа проводят по формуле:

Где: Х - содержание нитритов (нитрит-ионов) или нитратов (нитрат-ионов) мг/кг;

В - содержание нитрит-ионов или нитрат-ионов, найденные по соответствующим калибровочным кривым, мкг;

А - навеска анализируемого образца, г;

- общий объем фильтрата, мл (соответственно 50, 100 мл или другие объемы с учетом разведений);

- объем фильтрата, взятый для анализа, мл (5 или 10 мл соответственно).

Поскольку при диализе однородна равновесная концентрация минеральных солей устанавливается во всем объем раствора (в стакане и в растворе в диализном мешочке) при расчете принимается весь взятый для анализа объем раствора, или дистиллированной воды для диализа.