Приложение 5. Колориметрический метод определения метгемоглобина в крови с.х. животных

Приложение 5

Колориметрический метод определения метгемоглобина в крови с.х. животных

1. Принцип метода

Метод основан на сравнительном измерении оптической плотности растворов исследуемой крови с исходной концентрацией оксигемоглобина (гемоглобина) и параллельной пробы крови, в которой весь оксигемоглобин окислен до метгемоглобина феррицианидом калия, с использованием фотоэлектроколориметра при красном светофильтре.

2. Реактивы и растворы

Аммиак водный (), ГОСТ 3760-64

Калий железосинеродистый (феррицанид калия, соль кровяная красная, ГОСТ 4206-65

Гепарин (25000 ед.)

Трилон Б (комплексон III, хелатон, двунатриевая соль ЭДТА - двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты)

0,25%-ный раствор аммиака готовят, добавляя к 1 мл аммиака 99 мл дистиллированной воды

Насыщенный раствор феррицианида калия готовят, растворяя 70 г этой соли в 100 мл дистиллированной воды. Раствор можно хранить не более недели.

Раствор гепарина готовят путем прибавления к 5 мл гепарина 20 мл дистилированной воды.

Раствор трилона Б готовят путем растворения 50,0 г препарата в 500 мл дистиллированной воды, подогревая раствор при температуре 80° до полного растворения. Теплый раствор фильтруют через микропористый стеклянный фильтр N 3 или N 4, или через четыре слоя фильтровальной бумаги.

3. Приборы и посуда

Химические пробирки

Пипетки на 1,10 мл

Химические воронки или воронки со стеклянным фильтром N 3 или N 4

Фотоэлектроколориметр

4. Подготовка проб к анализу

Для анализа у исследуемых животных берут по 1-2 мл крови помещают ее в пробирку и стабилизируют кровь, добавив туда 2-3 капли раствора гепарина или трилона Б, перемешивают раствор и закрывают пробирки пробками.

Анализ проб на содержание метгемоглобина лучше проводить непосредственно после доставки проб, но при необходимости стабилизированную кровь хранят в холодильнике при температуре 2 - 4°.

Перед исследованием кровь тщательно перемешивают.

5. Ход анализа

В две химические пробирки наливают по 7,3 мл 0,25%-ного раствора аммиака и добавляют по 0,2 мл исследуемой крови (из одной пробы крови). В одну пробирку (пробирка N 2) добавляют 1-2 капли насыщенного раствора феррицианида калия, оставляют на 10 минут обе пробирки, а затем определяют величину светопоглощения (экстинцию) обоих растворов, используя для сравнения 0,25%-ный раствор аммиака.

В первой пробирке (пробирка N 1) определяют величину светопоглощения раствора крови с исходной концентрацией оксигемоглобина, или, что тоже гемоглобина, во второй (пробирка N 2) - величину светопоглощения раствора крови, в которой весь оксигемоглобин () превращен в метгемоглобин (МтНв).

Как отмечено выше, содержание оксигемоглобина в исходной пробе крови соответствует содержанию гемоглобина в ней.

Поскольку в параллельной пробе крови (пробирка N 2) весь гемоглобин полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, величина светопоглощения раствора с содержанием метгемоглобина практически постоянная и зависит от исходного уровня гемоглобина (оксигемоглобина).

6. Колориметрирование проб

Определение светопоглощения растворов крови в обеих пробирках проводят на фотоэлектроколориметре (ФЭКе) при красном светофильтре.

У ФЭК"ов различных марок длина волны, соответствующая максимуму пропускания при красном светофильтре, бывает различной. Так, у ФЭК"а - 56 при работе с красным светофильтром N 8 длина волны составляет 597 нм, у спектрофотоэлектроколориметров ФЭК - 56 ПМ и ФЭК - КФК - 2 длины волн при работе с красным светофильтром лежат в интервале 600 - 670 нм.

Определение светопоглощения растворов крови в обеих пробирках проводят с использованием ФЭК"ов различных марок при красном светофильтре в вышеприведенном интервале длин волн, используя для сравнения 0,25%-ный раствор аммиака, в кюветах с рабочей длиной 10 мм.

Различия, связанные с измерением экстинций растворов крови при различающихся длинах волн при работе на ФЭК"ах различиях марок, коррегируются путем введения в расчетную формулу коэффициента - величины приведенной экстинции раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (Е привед.), как показано в разделе - расчет результатов анализа. При расчете этой приведенной величины используют измеренные опытным путем величины светопоглощения раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (Е ) - пробирка N 1 и величины светопоглощения раствора крови с предельным содержанием метгемоглобина (Е МтНв) - пробирка N 2.

7. Расчет результатов анализа

Предварительно опытным путем на большой группе животных двух видов установлена средняя величина светопоглощения раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (Е ) и средняя величина светопоглощения раствора крови с полученным уровнем метгемоглобина (Е МтНв) для овец и коров.

В пробах крови овец первая величина (Е ) составила 0,15; вторая - (Е МтНв) - 0,57; для крупного рогатого скота эти величины составляют соответственно 0,17 и 0,79.

Поскольку гемоглобин в пробе крови полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, изменение светопоглощения, равное 0,42 (0,57 - 0,15) для овец и 0,62 (0,79 - 0,17) для крупного рогатого скота соответствует 100% содержания метгемоглобина.

Все эти данные были необходимы для выведения коэффициентов при расчете содержания метгемоглобина в крови животных по данной методике.

По методике проводят определение светопоглощения растворов исследуемой крови с исходным уровнем оксигемоглобина (пробирка N 1) и полученным уровнем метгемоглобина (пробирка N 2) и расчитывают содержание метгемоглобина в крови по нижеприведенным формулам, используя установленные коэффициенты и расчетное приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина с учетом коррекции измерения этой величины при красном светофильтре с различающимися длинами волн:

(1) для овец

(2) для к.р.с.

где: X - содержание метгемоглобина в исследуемой пробе крови, %

- приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина (Е ), расчет его приводится ниже

- среднее значение величины светопоглощения раствора оксигемоглобина, равное 0,15 для овец и 0,17 для к.р.с.

2,38 и 1,61 - расчетные коэффициенты, найденные из средних величин светопоглощения растворов оксигемоглобина и метгемоглобина для овец и к.р.с. (расчет их также приводится далее).

Значение Е2 - приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина (Е ) находят из пропорции с использованием измеренных величин светопоглощения раствора крови с исходным содержанием оксигемоглобина (пробирка N 1) и - метгемоглобина (пробирка N 2) в опыте.

откуда

где: - искомая величина - приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина;

- среднее значение оптической плотности раствора метгемоглобина, соответственно 0,57 для овец для расчета в формулу (1) и 0,79 для к.р.с., в формулу (2);

- измеренное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина (пробирка N 1);

- измеренное значение оптической плотности раствора метгемоглобина (пробирка N 2).

Значение подставляют в формулу (1) или (2) для расчета содержания метгемоглобина в крови овец или к.р.с.

Если приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина () будет равно или меньше средней величины оптической плотности раствора оксигемоглобина ( в формулах N 1 и 2), что объясняется индивидуальными колебаниями содержания гемоглобина в крови, содержание метгемоглобина в крови в этом случае будет равно или меньше 2,38 для овец и 1,61 для крупного рогатого скота.

Коэффициенты 2,38 и 1,61 были рассчитаны из средних показателей оптической плотности растворов метгемоглобина и оксигемоглобина в крови овец и коров соответственно по формулам:

Где: 0,42 - изменение светопоглощения растворов крови овец с содержанием мет- и оксигемоглобина (0,57 - 03,15), соответствующее 100%-ному содержанию метгемоглобина в крови овец;

0,01 - наименьший показатель оптической плотности, т.е.

0,42 - 100

0,01 - X

Подобным образом рассчитан коэффициент для к.р.с.