Приложение 8 (обязательное). Ускоренный метод определения общих и глюкозоположительных колиформных бактерий

Приложение 8
(обязательное)

Ускоренный метод определения общих и глюкозоположительных колиформных бактерий

Обнаружение ОКБ в расфасованной воде выполняют методом мембранной фильтрации или титрационным по МУК 4.2.1018-01.

При необходимости получения быстрого ответа о качестве воды, при производственном контроле определение ОКБ и ГКБ проводят ускоренным методом.

Определение общих колиформных бактерий методом мембранной фильтрации

Принцип метода заключается в использовании на этапе идентификации комбинации двух признаков ОКБ: первый (основной) - характер роста колоний на лактозной среде Эндо - темно-красные с отпечатком на обратной стороне фильтра, что подтверждает способность ферментировать лактозу до кислоты; второй - отрицательный оксидазный тест или способность к газообразованию. Поскольку лактозоположительные бактерии, ферментирующие лактозу до кислоты и газа, аналогично ферментируют глюкозу, то газообразование можно подтвердить на средах с любым углеводом, однако, использование подтверждающих сред с глюкозой целесообразнее, т.к. сокращает время анализа на сутки.

Выполнение анализа

Подготовка посуды, питательных сред и реактивов, техника мембранной фильтрации выполняется по МУК 4.2.1018-01.

Объем пробы воды 300 мл профильтровывают через мембранные фильтры, помещают на среду Эндо. Чашки с посевами ставят в термостат дном вверх и инкубируют при температуре в течение .

Если после инкубации на фильтрах нет роста или выросли колонии, не характерные для колиформных бактерий - плесневые, морщинистые, пленчатые, губчатые, расплывчатые, прозрачные - выдают отрицательный ответ.

Если на фильтрах обнаружен рост типичных для лактозоположительных бактерий колоний (выявляются благодаря дифференциальным свойствам лактозной среды Эндо) - темно-красных, красных с металлическим блеском или без него, слизистых розовых с отпечатком на обратной стороне фильтра - следует подтвердить их принадлежность к ОКБ. Для этой цели можно использовать один из вариантов.

Первый вариант

Выполняют оксидазный тест любым из методов (наложением мембранных фильтров на диск фильтровальной бумаги, смоченной реактивом, нанесением штрихом культуры на полоску фильтровальной бумаги, смоченной реактивом, накалыванием реактива на колонию и другими). При изменении цвета всех колоний (оксидазоположительные) дают отрицательный ответ.

Не изменившие цвета после контакта с реактивом типичные колонии подсчитывают и относят к группе ОКБ.

Второй вариант

Подсчитывают число типичных колоний каждого типа и подтверждают их способность образовывать кислоту и газ путем посева на полужидкую среду с глюкозой. Исследуют не менее 2-3 колоний каждого типа. Посевы инкубируют при температуре 37°С. Просмотр реакции проводят через 4-6 часов и при наличии кислоты и газа дают положительный ответ. Пробирки, где образовалась только кислота или среда не изменилась, оставляют для окончательного учета через 24 часа.

К группе ОКБ относят бактерии, образующие типичные колонии на среде Эндо и кислоту и газ при ферментации глюкозы. Допускается использование любых тест-систем для установления способности газообразования при ферментации углевода, имеющие сертификат качества.

Примечание. При производственном контроле наличие ОКБ служит основанием к приостановке выдачи сертификата качества на данную партию продукции. Дальнейшую идентификацию выросших розовых колоний можно не продолжать.

Определение глюкозоположительных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации

В индикаторную группу ГКБ входят помимо ОКБ еще и лактозоотрицательные бактерии семейства Enterobacteriaceae, оксидазоотрицательные, растущие на среде Эндо в виде разного типа розовых колоний, ферментирующие глюкозу до кислоты и газа при температуре .

Принцип метода определения ГКБ заключается в подтверждении наличия бактерий, ферментирующих глюкозу до кислоты и газа в том же посеве, что и для определения ОКБ. При обнаружении типичных и розовых (или только розовых) колоний подсчитывают ОКБ, а затем продолжают идентификацию розовых колоний по оксидазному тесту и способности образования кислоты и газа на подтверждающих средах с глюкозой.

Выполнение анализа

Если на фильтрах помимо типичных выросли колонии, характерные для лактозоотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae - розовые, розовые с красным центром, бледно-розовые, белесые (или только лактозоотрицательные), выполняют оксидазный тест путем помещения мембранного фильтра на кружок фильтровальной бумаги, обильно смоченный реактивом для оксидазного теста. При признаках проявления реакции, но не позднее, чем 5 минут, фильтр переносят обратно на среду Эндо и учитывают результат после четкого проявления реакции.

Если все колонии изменили цвет (оксидазоположительные), дают отрицательный ответ.

При наличии колоний, не изменивших цвет (оксидазоотрицательных), подсчитывают число таких колоний каждого типа и производят пересев в полужидкие среды с глюкозой. Исследуют не менее 2-3 колоний каждого типа. Инкубируют посевы при 37°С в течение 4-24 часов. В качестве ОКБ подсчитывают типичные колонии. В качестве ГКБ подсчитывают в сумме колонии как типичные, так и розовые, которые способны образовывать кислоту и газ при ферментации глюкозы.

Учет результатов анализа при определении общих и глюкозоположительных колиформных бактерий

При отсутствии роста на мембранных фильтрах или при отрицательном ответе в подтверждающих тестах в протоколе анализа указывают: ОКБ и ГКБ не обнаружены в 300 мл.

При росте на фильтрах типичных колоний лактозоположительных бактерий и подтверждении их принадлежности к группе ОКБ (либо с отрицательным оксидазным тестом, либо ферментирующих глюкозу до кислоты и газа) их число суммируют, сумму делят на три и в протоколе анализа указывают: число КОЕ ОКБ/100 мл; и число КОЕ ГКБ/100 мл. В данном случае результаты по ОКБ и ГКБ - одинаковые, поскольку ОКБ ферментируют как лактозу, так и глюкозу до кислоты и газа.

При росте на фильтрах помимо типичных еще и розовых колоний оксидазоотрицательных бактерий, а также только розовых, подсчитывают число колоний, ферментирующих глюкозу до кислоты и газа при температуре 37°С, затем суммируют с числом ОКБ, делят на три. В протоколе анализа указывают результат: число КОЕ ГКБ/100 мл.

Обнаружение оксидазоположительных колоний служит показанием к проведению анализа на обнаружение Ps. aeruginosa.

Определение общих и глюкозоположительных колиформных бактерий титрационным методом

Ускорение анализа достигают использованием на первом этапе анализа в качестве среды накопления глюкозопептонной среды. Этот прием позволяет в одном посеве определять ОКБ и ГКБ, что возможно благодаря способности ОКБ ферментировать как лактозу, так и глюкозу, как основной биохимический признак семейства Enterobacteriaceae. Кроме того накопление колиформных бактерий в среде с глюкозой происходит более интенсивно за счет быстрого разложения глюкозы по сравнению с лактозой, что сокращает время анализа на сутки.

Выполнение анализа

Глюкозопептонную среду готовят также, как лактозопептонную, заменив углевод лактозу на глюкозу МУК 4.2.1018-01.

Исследуемый объем воды 300 мл засевают в три емкости с 10 мл концентрированной глюкозопептонной среды по 100 мл в каждую емкость. Посевы инкубируют при температуре в течение 24 часов.

Отсутствие измененения среды позволяет дать отрицательный ответ.

Из посевов в среду накопления, где отмечено помутнение и газообразование или только помутнение производят высев на сектора среды Эндо с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре в течение 16-18 часов.

При обнаружении роста на секторах характерных для колиформных бактерий колоний выполняют оксидазный тест одним из способов (нанесением штрихом колонии каждого типа на полоску фильтровальной бумаги, смоченной реактивом; нанесением капли реактива на часть сектора).

Отрицательный ответ дают в следующих случаях:

- в среде накопления нет признаков роста;

- на секторах среды Эндо нет роста;

- на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные, с неровными краями, расплывчатые);

- все колонии на секторе оказались оксидазоположительные.

В протоколе анализа сообщают: отсутствие ОКБ в 300 мл и отсутствие ГКБ в 300 мл.

При обнаружении на секторах роста типичных оксидазоотрицательных колоний - темно-красных, красных, с металлическим блеском или без него дают ответ о наличии ОКБ и ГКБ в пробе воды. В протоколе аназлиза сообщают: обнаружение ОКБ в 300 мл, обнаружение ГКБ в 300 мл.

Если на секторах не выявлен рост типичных колоний, а обнаружены розовые оксидазоотрицательные колонии и при этом в среде накопления установлено газообразование - дают ответ о наличии ГКБ. В протоколе анализа сообщают: обнаружение ГКБ в 300 мл.

Данный анализ является качественным. При необходимости получения количественного результата производят посев в глюкозопептонную среду трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл и устанавливают в каждой емкости наличие ОКБ и ГКБ, как указано выше.

При определении ОКБ учитывают емкости, при высеве из которых на среде Эндо обнаружены типичные колонии.

При определении ГКБ учитывают в сумме емкости, где на секторах среды Эндо обнаружены типичные колонии ОКБ, а также розовые, при газообразовании в среде накопления выдают ответ: НВЧ КОЕ ОКБ в 100 мл или НВЧ КОЕ ГКБ в 100 мл.

Результаты определяют по таблице МУК 4.2.1018-01.

Примечания.

В соответствии с СанПиН единицей измерения ОКБ ГКБ и ТКБ является 100 мл, а норматив по этим показателям - отсутствие колиформных бактерий в 300 мл.

Норматив - это научно обоснованная величина, указывающая (при его соблюдении) на вероятность обеспечения эпидемической безопасности водопользования в отношении кишечных инфекций.

Единица измерения 100 мл условно принята для выражения количественного результата в целях сопоставления данных на международном уровне, а также при исследовании воды различных объектов и при работе разными методами (мембранным или титрационным). При работе титрационным методом результат может быть высчитан только на 100 мл в соответствии с международными статистическими таблицами расчета НВЧ (наиболее вероятного числа) микроорганизмов.