Приложение 10 (обязательное). Метод определения колифагов в воде

Приложение 10
(обязательное)

Метод определения колифагов в воде

Принцип метода определения колифагов

Метод заключается в предварительном размножении колифагов в среде обогащения в присутствии Е. coli и последующем его выявлении в виде зон лизиса (просветления) на газоне Е. coli на питательном агаре.

Выполнение анализа при определении колифагов

Подготовка посуды, питательных сред (питательный агар готовят по способу указанному на этикетке), мембранных фильтров, ведение культуры Е. coli, методика подтверждения фаговой природы лизиса выполняется на МУК 4.2.1018-01.

Накануне проведения анализа культуру Е. coli засевают в две пробирки со скошенным агаром. Через инкубации при температуре производят смыв бактерий с косяков 5 мл стерильного физиологического раствора и по стандарту мутности готовят взвесь Е. coli в концентрации бактериалных клеток в мл.

В исследуемую воду объемом 1000 мл вносят 100 мл 10-кратного питательного бульона и 10 мл смыва Е. coli. Для контроля культуры 0,1 мл смыва Е. coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.

Подготовленную пробу воды и чашку Петри с контролем Е. coli помещают в термостат и инкубируют при температуре в течение .

После инкубации, при отсутствии колифагов на контрольной чашке, в стерильную пробирку отливают 10 мл и эту пробу освобождают от бактериальной флоры одним из двух методов.

1. В 10 мл пробы добавляют 1 мл хлороформа, пробирку закрывают стерильной резиновой или силиконовой пробкой, энергично встряхивают в течение 3-5 минут для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставляют на 15 минут при комнатной температуре для полного осаждения хлороформа. Для дальнейшего исследования отбирают 1 мл пробы не касаясь хлороформа.

2. 10 мл пробы фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мм, подготовленный по п. 7.1 МУК 4.2.1018-01. Фильтрат в объеме 1-2 мл отбирают в стерильную пробирку, помещенную в колбу Бунзена или непосредственно в стерильную колбу Бунзена. Полученный фильтрат используют для дальнейшго исследования.

В предварительно расплавленный и остуженный до 45°С питательный агар добавляют приготовленный смыв бактерий Е. coli из расчета 1,0 мл смыва на 100 мл агара. В стерильную чашку Петри пипеткой переносят 1 мл пробы освобожденной от сопутствующей бактериальной флоры одним их двух предложенных методов. Сверху пробу заливают подготовленным агаром. В качестве контроля Е. coli дополнительно заливают одну стерильную чашку Петри. Залитые чашки осторожно покачивают для равномерного распределения агара. После застывания агара чашки переворачивают и помещают в термостат на при .

Если исследуется несколько проб, то целесообразно использовать одну чашку Петри, которую необходимо залить агаром с Е. coli. После застывания агара разделить его поверхность на сектора (не более 6), пронумеровать их согласно количеству исследованных проб. На каждый сектор нанести каплю микропипеткой или штрихом стерильной бактериологической петлей из исследуемой пробы воды, оставив один сектор в качестве контроля.

Учет результатов

Просмотр чашек после инкубирования осуществляется в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса газона Е. coli, наличии отдельных зон лизиса или единичных бляшек на чашке с исследуемой пробой воды при отсутствии зон лизиса или отдельных бляшек на контрольной чашке или контрольном секторе.

В протоколе отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 1000 мл воды.

При наличии зон лизиса в контроле результат считатеся недействительным. Анализ следует повторить с новой культурой Е. coli.