Приложение 9. Метод определения Pseudomonas aeruginosa

Приложение 9

Метод определения Pseudomonas aeruginosa

Приготовление питательных сред. Среда Бонде.
Натрий лимоннокислый трехзамещенный	28 г;
Натрий-аммоний фосфорнокислый	15 г;
Калий фосфорнокислый однозамещенный	10 г;
Магний сернокислый (сульфат магния)	2 г;
Вода дистиллированная	1000 мл.

Ингредиенты растворяют при нагревании, стерилизуют при 1 атм. 20 мин. Перед посевом добавляют 5 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллического фиолетового на 100 мл среды.

Среда "Блеск"

100 мл питательного агара, стерильного, приготовленного из сухого препарата по прописи на этикетке, расплавляют на водяной бане. После охлаждения до температуры (приблизительно) 50°С добавляют 0,3 г L-аргинина, 8 мл 10% водного раствора трифенилтетразолий хлорида (ТТХ), 10 мл стерильного обезжиренного теплого молока, тщательно перемешивают и разливают в чашки не тонким слоем (не менее 25 мл).

Выполнение анализа

Исследуют пробу воды объемом 1000 мл, разделенную в две емкости по 500 мл. В каждую емкость добавляют по 50 мл среды Бонде, тщательно перемешивают и инкубируют при температуре в течение 24-48 часов.

Через 24 часа просматривают посевы. При наличии роста Pseudomonas aeruginosa происходит помутнение среды Бонде и на поверхности появляется тонкая прозрачная пленка, часто поднимающаяся по стенке емкости. В журнале отмечают помутнение среды и образование пленки.

Для подтверждения Pseudomonas aeruginosa делают посев на среду "Блеск". Емкость перед посевом не взбалтывать. Петлей забирают пленку и делают посев штрихом для получения изолированных колоний и по 3-4 бляшки из каждой емкости. Посев в виде бляшки: делают укол петлей до дна чашки и затем растирают небольшую площадку вокруг укола по поверхности среды. Допустимо делать посев нескольких проб на секторах одной чашки. Посевы со средой "Блеск" инкубируют при температуре в течение 24 часов.

Емкости со средой Бонде оставляют в термостате еще на 24 часа для окончательного учета.

Через 24 часа отмечают характер роста на среде "Блеск". При наличии в пробе Ps. aeruginosa на среде "Блеск" вырастают темно-красные колонии с золотистым блеском или золотистыми вкраплениями на "бляшках". Появление блеска можно наблюдать уже через 20-22 часа инкубации при температуре 37°С, но максимального развития реакция достигает через 42-44 часа.

Если на среде "Блеск" не отмечено роста или выросли колонии темно-красные, темно-вишневые, но без характерного блеска, то из емкостей, где отмечено помутнение или помутнение с пленкой, высев следует повторить через 48 часов.

При отсутствии роста в среде Бонде через 24 часа пробу инкубируют до 48 часов и в случае помутнения и образования пленки подтверждают Ps. aeruginosa на среде "Блеск", как указано выше.

Подтвердить наличие Ps. aeruginosa также можно путем посева подозрительной изолированной колонии на косяк с питательным агаром, на котором через 24 часа инкубации при температуре 37°С в случае положительной реакции появляется синий, сине-зеленый, зелено-желтый пигмент. Пигментация может усиливаться при последующем выдерживании косяка на свету при комнатной температуре.

Отрицательный ответ выдают:

- при отсутствии признаков роста в посевах пробы в среду Бонде;

- при отсутствии роста на среде "Блеск";

- при росте на среде "Блеск" не характерных для Ps. aeruginosa колоний без блеска.

- Результат сообщают: Ps. aeruginosa не обнаружена в 1000 мл воды.

- Положительный ответ выдают:

- при росте на среде "Блеск" темно-красных колоний с золотистым блеском;

- при образовании характерного пигмента на питательном агаре.

При четкой реакции на среде Бонде (муть и пленка) и среде "Блеск" наличие пигмента определять не обязательно.

Результаты вносят в протокол анализа: Ps. aeruginosa обнаружена в 1000 мл воды.