Приложение Д (обязательное). Определение массовой доли отдельных сахаров (углеводного состава) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Приложение Д
(обязательное)

Определение массовой доли отдельных сахаров (углеводного состава) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Д.1 Сущность метода заключается в лигандообменном или гельпроникающем хроматографическом разделении сахаров патоки с рефрактометрическим детектированием.

Метод предназначен для определения углеводного состава патоки. Метод не применим для смесей сахаров, содержащих совместно сахарозу и мальтозу.

Д.2 Средства измерений, вспомогательные устройства и реактивы

Хроматограф жидкостный с пределом основной допускаемой погрешности (по площади пиков) не более 10%, состоящий из:

- изократического двухплунжерного насоса, обеспечивающего расход элюента 0,2-3,0  и максимальное давление не менее 110 атм.;

- колонки хроматографической для лигандообменной или гельпроникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии. Например "Chrompack Carbohydrates Са" (сополимер стирол-дивинилбензол с привитым кальцием);

- термостата колонки, поддерживающего постоянную температуру колонки в пределах 80°С с погрешностью не более °С;

- рефрактометрического детектора с встроенным или внешним термостатом измерительной ячейки;

- инжектора петлевого типа "Reodyne" с дозирующей петлей 20 мкл или автосэмплера;

- дегазатора элюента в потоке и предколонки для деминерализации пробы в потоке;

- интегратора или компьютерной системы обработки хроматографических данных.

Вода бидистиллированная. Используется в качестве элюента.

Глюкоза, фруктоза, мальтоза, мальтотриоза аналитической степени чистоты. Например реактивы производства фирмы "SIGMA" (каталожные номера М-9171, М-8378, G-7528, F-2543).

Фильтры мембранные типа "Sartorius" или "Millipore" диаметром отверстий 0,22-0,45 мкм.

Установка для фильтрования или медицинский шприц с насадкой для фильтрования через мембранные фильтры.

Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 и 500 или 1000 г по ГОСТ 24104.

Термометр жидкостный стеклянный, диапазон измерения от 0°С до 100°С, цена деления шкалы 1°С по ГОСТ 28498.

Колбы мерные 1-50-2 по ГОСТ 1770.

Стаканы стеклянные B1-150, В1-200 ТС или ТХС по ГОСТ 25336.

Пробирки пластиковые.

Палочки стеклянные или пластиковые.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

Д.3 Подготовка к проведению анализа

Д.3.1 Подготовка пробы анализируемого образца патоки

Для анализа готовят 1%-ный раствор патоки в пересчете на сухое вещество. Для этого определяют массовую долю сухого вещества патоки по 5.2.4 или 5.2.5 и вычисляют массу навески , г, необходимую для приготовления 1% раствора по формуле

, (Д.1)

где - массовая доля сухого вещества патоки, %;

100 - пересчет на сухое вещество патоки, %;

1 - массовая доля сухого вещества в 100 г 1%-ного раствора, г.

Стакан с палочкой помещают на весы и устанавливают нуль, вносят массу навески патоки и приливают теплую бидистиллированную воду до 100 г. Палочкой тщательно перемешивают раствор до полного растворения патоки. Приготовленный раствор фильтруют через мембранный фильтр в сухую чистую пробирку или в виалу автосэмплера.

Подготовленную пробу анализируют в течение 1-2 ч после приготовления.

Подготовленная проба может храниться в течение 3 мес в замороженном виде.

Д.3.2 Приготовление стандартных растворов для определения времени удержания сахаров

Стандартные 1%-ные растворы сахаров (фруктозы, глюкозы, мальтозы и мальтотриозы), а также их смеси готовят на бидистиллированной воде. В стеклянный стакан помещают навеску сахара, взятую с учетом содержания основного компонента реактива, приливают 10-15  воды, растворяют и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 , доводят его объем водой до метки при температуре раствора 20°С. Приготовленные растворы фильтруют через мембранные фильтры в пластиковые пробирки. Пробирки закрывают крышками и замораживают в холодильнике. В замороженном состоянии растворы сахаров хранят до одного года. Перед началом работы растворы размораживают, используя для этого теплую воду или микроволновую печь в режиме размораживания.

Д.3.3 Определение времени удержания сахаров и оценка эффективности разделения

Включают хроматограф и настраивают его согласно инструкции по эксплуатации. Скорость потока элюента, температуру термостата колонки устанавливают в соответствии с рекомендациями, приведенными в паспорте на хроматографическую колонку. Температура термостата детектора 50°С.

Для идентификации пиков сахаров необходимо определить время удержания сахаров. Для этого поочередно анализируют стандартные растворы сахаров и их смесь.

Рекомендуется для определения времени удержания, вычисления площадей пиков и расчетов применять интеграторы или компьютерные системы обработки хроматографических данных.

Относительное время , с, удержания каждого сахара (x) вычисляют по формуле

, (Д.2)

где - абсолютное время удержания каждого сахара, с;

- абсолютное время удержания глюкозы, с.

Эффективность хроматографической колонки по глюкозе, теоретические тарелки a вычисляют по формуле

, (Д.3)

где - абсолютное время удержания глюкозы, с;

- ширина пика на уровне 50% высоты, с;

5,54 - коэффициент.

Эффективность хроматографической колонки по глюкозе должна быть не менее 2000 теоретических тарелок.

Для колонок "Chrompack Carbohydrates Са" 300 x 6,5 мм относительное время удержания сахаров по глюкозе приведены в таблице Д.1.

Таблица Д.1

Сахара х	Относительное время удержания
Фруктоза	1,197-1,212
Глюкоза	1,000
Мальтоза	0,796-0,812
Триозы	0,699-0,712

Д.4 Проведение анализа

Аликвоту пробы патоки, подготовленную по Д.2.1, вводят в хроматограф при помощи ручного инжектора или автосэмплера. Объем аликвоты 20 мкл. Регистрацию сигнала детектора проводят при помощи самописца, интегратора или компьютерной системы обработки хроматографических данных (например Multi-Chrom; HP ChemStation и т.п.).

Проводят два параллельных определения.

Д.5 Обработка результатов

Д.5.1 После получения хроматограммы проводят обработку данных методом внутренней нормализации по формуле

, (Д.4)

где - массовая доля сахара х в пробе,%;

- площадь пика сахара x;

- сумма площадей всех пиков сахаров.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений.

Вычисления проводят до второго десятичного знака с последующим округлением до первого десятичного знака.

Сходимость результатов определений (допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений) не должна превышать 0,5% абс.

Воспроизводимость результатов анализа (допустимые расхождения между результатами анализов, выполненных в разных лабораториях, не должна превышать 1,5% абс.

Допускаемая абсолютная погрешность анализа %.

Д.6 Расчетный метод определения массовой доли редуцирующих веществ по данным углеводного состава

Метод применим при массовой доле редуцирующих веществ 26% - 90%. Результаты определения углеводного состава патоки позволяют вычислить массовую долю редуцирующих веществ патоки , %, в пересчете на сухое вещество по формуле

, (Д.5)

где - массовые доли сахаров: глюкозы, фруктозы, мальтозы, триозы в пересчете на сухое вещество, %;

0,180 - усредненное значение коэффициента для высших сахаров ;

- массовая доля высших сахаров в пересчете на сухое вещество, %.

Расхождения массовой доли редуцирующих веществ, определенных методом Лейна-Эйнона (5.2.8) и расчетным методом, должны быть не более 1%.

Если расхождения превышают 1%, то необходимо провести корректировку коэффициента для высших сахаров.

Д.6.1 Проведение корректировки коэффициента для высших сахаров

Коэффициент для высших сахаров зависит от вида ферментов, применяемых для производства патоки, поэтому для разных видов патоки этот коэффициент будет немного отличаться.

Для проведения корректировки отбирают 10 проб патоки одного вида и проводят определение массовой доли редуцирующих веществ по 5.2.8 (метод Лейна-Эйнона). Вычисляют коэффициент для высших сахаров каждой пробы по формуле

, (Д.6)

где - результат определения массовой доли редуцирующих веществ методом Лейна-Эйнона (5.2.8), %.

Вычисляют среднеарифметическое значение коэффициента .

Полученное значение используется в формуле (Д.5) для вычисления массовой доли редуцирующих веществ патоки этого вида.