Приложение 1. Способ приготовления питательных сред, используемых для контроля эффективности стерилизации

Приложение 1

Способ приготовления питательных сред,
используемых для контроля эффективности
стерилизации

1. Тиогликолевая среда

1.1. Состав

гидролизат казеина (в пересчете на сухой остаток) - 15 г;

дрожжевой экстракт (10% в пересчете на сухой остаток) - 5 г;

натрий хлорид - 2,5 г

глюкоза - 5 г

цистин - 0,75 г

тиогликолевая кислота - 0,3 мл

раствор резазурина 1:1000 свежеприготовленный - 1 мл

агар-агар дальневосточный - 0,75 г

вода дистиллированная до 1000 мл

рН среды после стерилизации 7,0 - 7,2

1.2. Приготовление.

Смешивают все компоненты среды, кроме глюкозы и тиогликолевой кислоты.

Цистин предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды при постепенном добавлении 10-20% раствора едкого натра до его полного растворения. Смесь подщелачивают 10% раствором едкого натра до рН 8,0 - 8,2, кипятят в котле с паровой рубашкой или на открытом огне при постоянном перемешивании до расплавления агар-агара 5-10 минут. Можно автоклавировать 20 минут при 100 град., затем прибавляют горячую воду до первоначального объема, прибавляют глюкозу и тиогликолевую кислоту, фильтруют через полотно, устанавливают рН 7,2 - 7,3. Добавляют раствор резазурина, смешивают и разливают в стерильные пробирки по 20 мл. Стерилизуют 20 минут при 120 град.

Тиогликолевую среду можно хранить до посева, предохраняя ее от света, при комнатной температуре в течение не более 7 суток со дня приготовления.

Примечание:

1. Допускается приготовление среды без раствора резазурина натрия.

2. Допускается применение других сортов агара, но с заранее вытитрованным количеством.

2. Питательный агар с 0,5% глюкозы

2.1. Состав.

Панкреатического гидролизата казеина (в пересчете на сухой остаток) - 15 г

дрожжевого экстракта (10%) (в пересчете на сухой остаток) - 5 г

глюкозы - 5 г

натрия хлористого (с учетом содержания в гидролизате) - 5 г

агар-агара (в зависимости от плотности агара) - 10-20 г

воды дистиллированной - до 1000 мл

рН среды после стерилизации 7,2 - 7,4

2.2. Приготовление.

Смешивают все компоненты среды, кроме глюкозы, подщелачивают 10-20% раствором аОН до рН 8,0-8,2 и оставляют на 20-30 минут для набухания агар-агара. Затем его расплавляют в автоклаве текучим паром или в открытом котле с подогреванием в течение 30 минут, отстаивают 20-30 минут, отфильтровывают через ватный фильтр. На полученный после фильтрации объем среды добавляют глюкозу, устанавливают рН 7,3-7,5, разливают в стерильные пробирки по 5 мл. Стерилизуют при 110-112 град.С (0,5 ати) - 30 минут.

Химические показания: аминный азот 30-110

хлориды 0,5-0,6%

Агар годен для применения в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике (4-10 град.С) или 1 месяц при комнатной температуре.

3. Бульон Хоттингера с 0,5% (1,0%) глюкозы

3.1. Состав

Мясной перевар по Хоттингеру до разведения аминного азота на 140-160 мг%

Натрий хлористый - 0,5%

Глюкоза - 0,5% (1,0%)

вода дистиллированная - до 1000 мл

рН среды 7,2-7,4

3.2. Приготовление

Смешивают мясной перевар по Хоттингеру с водой в таком соотношении, чтобы в среде содержалось 140-160 мг% аминного азота, добавляют хлористый натрий. Смесь подщелачивают 10% аОН до рН 8,08,2, кипятят на открытом огне 10 минут или автоклавируют при 100 град.С 10 минут. Если есть выкипание, доводят объем до первоначального кипяченой или дистиллированной водой. Фильтруют через ватный тампон, прибавляют 0,5% (1,0%) глюкозы, устанавливают рН 7,3-7,5 добавлением 5% НСl. Снова фильтруют через бумажный фильтр или полотно "Бельтинт". Разливают в стерильную посуду.

Стерилизуют при 110 град. 30 минут.

4. Среда Сабуро

4.1. Состав.

Сухой пептон ферментативный 10 г

Глюкоза или мальтоза 100 г

Вода дистиллированная до 1000 г

рН среды после стерилизации 5,5-5,8

4.2. Приготовление

В воду добавляют пептон и кипятят 10 минут. Фильтруют через полотно "Бельтент". К полученному объему после фильтрами прибавляют глюкозу или мальтозу. Если рН выше, чем 5,7, то следует подкислить 5% раствором НС до рН 5,7.

Разливают в стерильные пробирки по 10 мл.

Стерилизуют при 110 (0,5 кгс/см2 - 30 минут).

5. Контроль стерильности питательных сред

Для контроля стерильности питательные среды после изготовления и стерилизации помещают в термостат при температуре 37 град.С на двое суток.

Сахарный бульон Хоттингера и среду Сабуро контролируют полностью (всю приготовленную серию пробирок или колб).

Тиогликолевую среду выдерживают при повышенной температуре до использования не допускается, поэтому от каждой серии отбирают 1% от общего числа пробирок или колб и выдерживают их в термостате при температуре 37 град.С в течение 2-х суток. Для контроля стерильности эту часть сред не используют.

Подготовка посуды

Новую посуду для мытья кипятят в слабом растворе (1-2%) соляной кислоты во избежания дальнейшего выщелачивания стекла.

Мытье производят ершами с мылом и содой, затем тщательно промывают проточной и ополаскивают дистиллированной водой, что предупреждает выпадение содовых остатков при высушивании.

Приготовленную и высушенную посуду завертывают в бумагу и стерилизуют.