Приложение N 2. Инструкция по бактериологическому контролю комплекса санитарно-гигиенических мероприятий в лечебно-профилактических учреждениях (отделениях хирургического профиля, в палатах и отделениях реанимации и интенсивной терапии)

Приложение N 2

к приказу Минздрава СССР

от 2 августа 1978 г. N 720

Инструкция
по бактериологическому контролю комплекса санитарно-гигиенических
мероприятий в лечебно-профилактических учреждениях
(отделениях хирургического профиля, в палатах и отделениях
реанимации и интенсивной терапии) *

1. Общие положения

1.1. Инструкция по бактериологическому контролю комплекса санитарно-гигиенических мероприятий и контролю стерильности изделий медицинского назначения предназначена для работников бактериологических лабораторий и дезинфекционных станций системы Министерства здравоохранения, осуществляющих бактериологический контроль.

1.2. Бактериологические лаборатории санитарно-эпидемиологических и дезинфекционных станций проводят контроль не реже двух раз в год, бактериологические лаборатории лечебных учреждений контролируют санитарно-гигиенический режим (обсемененность различных объектов и воздуха) один раз в месяц, а контроль стерильности инструментов, перевязочного материала, операционного белья, рук хирургов и кожи операционного поля (выборочно) - 1 раз в неделю.

1.3. Объектами исследования при проведении бактериологического контроля являются:

- воздушная среда;

- различные объекты внешней среды;

- хирургический инструментарий;

- шприцы, иглы;

- системы переливания крови многократного использования;

- зонды, катетеры, бужи, резиновые перчатки и др. изделия из резины и пластикатов;

- хирургический шовный материал, подготовленный к использованию;

- руки хирургов и кожа операционного поля.

2. Методика микробиологических исследований

2.1.Исследование микробной обсемененности воздушной среды.

2.1.1.Бактериологическое исследование воздушной среды

                                                               3

предусматривает: - определение общего содержания микробов в 1 м  воздуха.

                                                3

- Определение содержания зол. стафилококка в 1 м  воздуха.

2.1.2. Отбор проб воздуха для бактериального исследования проводят в следующих помещениях:

- операционных блоках;

- перевязочных;

- послеоперационных палатах;

- отделениях и палатах реанимации и интенсивной терапии и др. помещениях требующих асептических условий.

2.1.3. Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с помощью аппарата Кротова.

Скорость протягивания воздуха составляет 25 л в минуту. Количество пропущенного воздуха должно составлять 100 литров для определения общего содержания бактерий и 250 литров для определения наличия зол.стафилококка. Исследование воздуха седиментационным методом допускается в исключительных случаях.

                                                               2

     2.1.4. Для определения общего содержания бактерий  в  1  м   воздуха

забор проб проводят  на  2%  питательном  агаре.  Посевы  инкубируют  при

температуре 37 град. С в течение 24 часов, затем оставляют   на  24  часа

при комнатной температуре, подсчитывают количество  колоний,  выросших  и

                            3

производят перерасчет на 1 м  воздуха. Если на чашках питательного  агара

выросли колонии плесневых грибов, их подсчитывают и делают пересчет на  1

 3

м  воздуха. В протоколе количество плесневых грибов указывают отдельно.

Примечание: При переносе аппарата Кротова из одного помещения в другое его поверхность обрабатывают дезинфицирующим раствором. Столик, внутренние стыки и крышку прибора с внутренней и внешней стороны протирают спиртом (70град.)

2.1.5. Для определения наличия зол. стафилококка забор проб проводят на желточно-солевой агар (ЖСА). Чашки помещают в термостат при 37 град.С на 24 часа и выдерживают еще 24 часа при комнатной температуре. Колонии, подозрительные на стафилококк, подлежат обязательной микроскопии и дальнейшей идентификации.

С желточно-солевого агара снимают в первую очередь колонии стафилоккокка, которые образуют радужный венчик вокруг колонии (положительная лецитовителлазная реакция), дальнейшему изучению подвергаются также пигментированные колонии и с отрицательной лецитовителлазной реакцией. Подозрительные колонии пересевают на чашки с кровяным или молочным агаром. Дальнейшее изучение их проводят по схеме.

Схема бактериологического исследования на стафилококк.

1. Первый день.

Посев на элективные среды (желточно-солевой, молочно-солевой или Молочно-желточно-солевой агар). Засеянные среды выдерживают в термостате при 37 град.С в течение 2 суток либо одни сутки в термостате и дополнительно 24 часа на свету при комнатной температуре.

3. Второй - третий день.

Просмотр чашек, фиксация в журнале характера и массивности роста. На выше указанных средах стафилококк растет в виде круглых, блестящих, маслянистых, выпуклых, пигментированных колоний. На средах, содержащих желток, зол. стафилококк, выделенный от человека, в 60-70% случаев образует радужный венчик вокруг колонии (положительная лецитовителлазная реакция). Стафилококки животного происхождения дают положительную лецитовителлазную реакцию в 5-10% случаев.

Отвивка на скошенный агар для дальнейшего исследования не менее 2-х колоний, подозрительных на стафилококк. Для исследования отвивают прежде всего колонии, дающие положительную лецитовителлазную реакцию. При отсутствии на чашках таких колоний дальнейшему исследованию подвергаются пигментированные колонии, схожие по морфологии со стафилококком. При одновременном наличии на чашках колоний стафилококка, отличающихся по пигменту, следует отвивать не менее двух колоний различного вида. Пробирки с посевом помещают в термостат при 37 град.С на 18-20 часов.

4. Четвертый день.

После суточной инкубации у выделенных штаммов проверяют морфологию, тинкториальные свойства (окраска по Граму) и наличие плазмокоагулирующей активности. Следует отметить, что характер роста культуры на скошенном агаре в ряде случаев дает возможность "предвидеть" принадлежность ее к виду золотистого стафилококка или эпидермального стафилококка. Первые, как правило дают обильный равномерный, сочный рост, вторые - очень скудный и неравномерный рост по ходу посева.

Окраску по Граму проводят общепринятым методом. Под микроскопом окрашенные по Граму стафилококки имеют вид фиолетово-синих кокков, располагающихся гроздьями или небольшими кучками ("кружево").

Плазмокоагулирующую активность проверяемой в реакции коагуляции плазмы (РКП).

С учетом результатов РКП и лецитовителлазной активности в 70-75% случаев, на четвертый день исследования может быть подтвержена принадлежность выделенного штамма к виду зол. стафилококка и выдан соответствующий ответ. На схеме представлены возможные варианты сочетаний результатов определения плазмокоагилирующей и лецитовителлазной активности.

Если культура обладает только плазмокоагилирующей и только лецитивителлазной активностью, то для окончательного ответа требуется определение других признаков патогенности (ферментации маннита в аэробных условиях - АФМ или ДНКазной активности).

В этих случаях ответ выдают в зависимости от результатов, полученных при определении названных признаков.

В случае необходимости на 4-ый день исследования может быть поставлена реакция определения ДНКазной активности или анаэробной ферментации маннита.

Определение антибиограммы проводят только после выделения чистой культуры по показаниям (выбор способа лечения и т.д.).

Выделенные культуры золотистого стафилококка подлежат типированию

5. Пятый день.

Учет результатов фаготипирования, определения чувствительности к антибиотикам, ДНКазной активности. Окончательная выдача ответа.

Критерии оценки микробной обсемененности воздуха в хирургических клиниках

Место забора	Условия работы	Общее кол-во 3 колоний в 1 м воздуха	Количество патоген- ного cтафилококка в 250 литрах
Операционные	До начала работы Во время работы	не выше 500 не выше 1000	не должно быть не должно быть

2.2. Исследования микробной обсемененности объектов внешней среды.

2.2.1. Бактериологическое исследование микробной обсемененности предметов внешней среды предусматривает выявление синегнойной палочки, бактерий группы кишечных палочек и аэроманад (строго по показаниям). Забор проб с поверхностей различных объектов осуществляют методом смывов.

2.2.2. Взятие смывов производят стерильным ватным тампоном на палочках, вмонтированных в пробирки, или марлевыми салфетками размером 5х5 см, простерилизованными в бумажных пакетах или в чашках Петри. Для увлажнения тампонов в пробирки с тампонами наливают по 2,0 мл стерильного физиологического раствора. При использовании салфеток стерильный физиологический раствор разливают в стерильные пробирки по 20 мл. Салфетку захватывают стерильным пинцетом, увлажняют физиологическим раствором из пробирки после протирания исследуемого объекта помещают в ту же пробирку.

2.2.3. При контроле мелких предметов смывы забирают с поверхности всего предмета. При контроле предметов с большой поверхностью смывы проводят в нескольких местах исследуемого предмета площадью примерно в

            2

100 - 200 см .

2.4. Для выделения стафилококков делают посев непосредственно на чашку Петри с желточно-солевым агаром (см. схему исследования на стафилококк). Кроме того, в качестве среды накопления используют бульон с 6,5% хлористого натрия, бульон с 1% глюкозы, разлитые в пробирки по 0,5 мл, в которые засевают по 0,2-0,3 мл смывной жидкости. Засеянные пробирки инкубируют при 37 град. С в течение 20-24 часов, после чего делают высев на ЖСА (см. схему исследования на стафилококк).

2.2.5. Для выявления бактерий группы кишечных палочек производят посев на среду обогащения, для чего тампон (марлевую салфетку погружают в 10-20% желчный бульон или среду Кесслера. Через сутки инкубирования при 37 град. С делают пересев на среду Эндо. Подозрительные колонии на среде Эндо микроскопируют и пересевают на 2-ую бродильную пробу - среду Гисса с глюкозой. Среду выдерживают 24 часа при 43 град.С.

Примечание: При использовании свиной желчи для приготовления желчного бульона концентрация желчи должна быть в 20 раз меньше.

2.2.6.Для выявления синегнойной палочки специальные посевы можно не производить. Обычно колонии синегнойной палочки удается выявить на кровяном агаре или на среде Эндо. Колонии, подозрительные на синегнойную палочку, пересевают на скошенный агар, содержащий 2-5% глицерина или маннита. Колонии синегнойной палочки дают на поверхности скошенного агара обильный рост с зеленоватым оттенком, маслянистой консистенции с характерным медовым запахом. Выделенную культуру окрашивают по Граму, микроскопируют, определяют гемолитические свойства путем высева на чашку с кровяным агаром. Ориентировочный перечень объектов, подлежащих бактериологическому контролю:

А. Наркозная комната

1. Инкубационная трубка

2. Маска наркозного аппарата

3. Тройник наркозного аппарата

4. Гофрированная трубка

5. Ларингоскоп

6. Роторасширитель

7. Дыхательный мешок

8. Руки врачей-анестезиологов-реаниматологов сестер-анестезистов

Б. Предоперационная

1. Тазы для мытья рук хирургов

2. Чистые щетки для мытья рук

3. Фартуки (клеенчатые или полиэтиленовые)

В. Операционная

1. Рабочий стол анестезиологов

2. Операционный стол

3. Шланг вакуумнасоса

4. Шланг кислородной подводки

5. Смывы с рук всех участвующих в операции

6. Кожа операционного поля

Г. Послеоперационные палаты, отделения и палаты реанимации и интенсивной терапии

1. Кровать, подготовленная для больного

2. Полотенце для рук персонала и смывы с рук

3. Щетка на раковине

4. Шланг кислородной подводки

5. Запасная наркозная аппаратура (набор реанимационной укладки)

6. Шланг вакуумотсоса

7. Внутренняя поверхность холодильника (для хранения лекарств градусников)

8. Градусники

Д. Перевязочные

1. Кушетка для перевязок

2. Полотенце для рук персонала

3. Щетка на раковине

4. Халат медицинских сестер

5. Руки врачей, медицинских сестер

6. Рабочий медицинский стол

7. Внутренняя поверхность холодильника для хранения лекарств

3. Правила отбора проб для контроля стерильности
в лечебно-профилактических учреждениях

3.1. Забор проб на стерильность проводит операционная сестра под руководством сотрудника бактериологической лаборатории, в стерильные емкости с соблюдением строжайших правил асептики непосредственно перед проведением операции.

3.2. Для контроля стерильности используют следующие питательные среды:

- сахарный бульон Хоттингера (0,5 и 1% глюкозы);

- тиогликолевую среду;

- бульон Сабуро.

Одновременный посев изделий на 3 вышеуказанные среды обязателен. При посеве изделия или его части непосредственно в питательную среду количество среды в пробирке (колбе, флаконе и т.д.) должно быть достаточным для полного погружения изделия или его части.

3.3. Посевы в бульон Хоттингера и тиогликолевую среду выдерживают в термостате при температуре 37 град.С, среду Сабуро - при температуре 20-22 град.С.

Посевы инкубируют в термостате в течение 14 суток.

3.4. Описание состава, способа приготовления и правила контроля стерильности: питательных сред изложены в приложении 1.

4. Мероприятия обеспечивающие асептические условия при посевах

4.1. Требования к помещению для посева на стерильность.

4.1.1.Посев исследуемого материала желательно проводить в настольных боксах с ламинарным потоком воздуха. Эти боксы размещают в отдельных помещениях бактериологической лаборатории.

При отсутствии боксов с ламинарным потоком воздуха контроль стерильности проводят в боксированных помещениях (бокс с предбоксником).

                                            2

Общая площадь бокса должна быть не менее 3 м .

4.1.2. В боксированном помещении стены должны быть окрашены масляной краской и выложены картельной плиткой, не должны иметь выступов, карнизов, трещин; пол в боксе и рабочий стол должны быть покрыты линолиумом, стенки и ножки стола - покрашены масляной краской.

4.1.3. Боксы оборудуют приточно-вытяжной вентиляцией (с преобладанием притока над вытяжкой), в них подается стерильный воздух, проходящий через бактериальные фильтры с материалом Петрянова.

4.1.4. В боксе и предбокснике устанавливают настольные (БОН) и потолочные (ОБП) ультрафиолетовые облучатели из расчета вт. удельной

                                                2

мощности ламп, создающих прямое излучение на 1 м   помещения.  Облучатели

размещают на высоте 2-2,5 м от пола.

4.1.5. Для тушения пожара в боксированном помещении должны быть в наличии противопожарные средства, углекислотные огнетушители типа ОУ-2 из расчета один огнетушитель на предбоксник и бокс.

4.2. Подготовка бокса, инструментов и персонала к работе.

4.2.1. Ежедневно до проведения работы помещения бокса и предбоксника подвергают тщательной обработке. Стены, пол, поверхности инвентаря протирают раствором, содержащим 3% перекиси водорода и 0,5% моющего средства (Триас-А, Прогресс, Астра, Лотос). В случае обнаружения в воздухе грибов или споровых форм микроорганизмов, влажную уборку проводят 6% раствором перекиси водорода с 0,5% выше перечисленных моющих средств.

Внутреннюю поверхность настольного бокса обрабатывают также, как и помещение бокса. Через 45-60 минут после обработки в бокс вносят все необходимое для работы материалы и инструменты, кроме образцов продукции.

4.2.2. Перед внесением материалов в настольном боксе включают вентиляцию на время, достаточное для обеспечения полного обмена воздуха в нем.

4.2.3. За 1,5-2 часа до начала работы в боксе и предбокснике на 1,5-1 час включают бактерицидные лампы.

4.2.4. Инструменты, посуду и спецодежду, используемые в работе, предварительно стерилизуют и тканевые изделия обрабатывают при следующем режиме: температура 132 град.С+-2 град.С, время стерилизационной выдержки - 20 мин.; изделия из резины (перчатки и т.д.) - при температуре 120 град.С +2 град.С в течение 45 минут.

В процессе работы вспомогательный инструмент - 2-3 раза заменяют новым стерильным комплектом.

4.2.5. Перед входом в бокс работники лаборатории тщательно моют руки теплой водой с мылом и щеткой, вытирают стерильным полотенцем, одевают в предбокснике на ноги бахилы, стерильные халаты, 4-слойные маски, шапочки, стерильные перчатки.

4.2.6. В процессе посева в боксе регулярно проверяют обсемененности воздуха. Для этого на рабочий стол ставят 2 чашки с мясо-пептонным агаром (МПА), открывая их на 15 минут, затем чашки помещают в термостат при температуре 37 град.С на 48 часов. Допускается более трех колоний неспорообразующих санрофитов.

В случае роста на чашках более 3 колоний проведение дальнейших работ в данном боксе запрещается. В боксе дополнительно проводят тщательную обработку 6% раствором перекиси водорода с 0,5% моющего средства.

4.2.7. Контроль стерильности изделий проводят путем погружения в питательные среды. В исключительных случаях, когда необходимо проверить стерильность инструмента больших размеров, пробы забирают методом смыва

                                                      2

стерильной  марлевой   салфеткой   размером   5х5   см ,   предварительно

увлажненной   стерильным   физиологическим   раствором   или   стерильной

водопроводной водой.

4.2.8. Перед посевом исследуемый материал вносят в предбоксник, предварительно снимая наружную мягкую упаковку. В предбокснике пакеты, биксы протирают снаружи с помощью стерильного пинцета (корнцанга) стерильной салфеткой (ватным тампоном), обильно смоченной 6% раствором перекиси водорода, перекладывают на стерильный лоток и оставляют на 30 минут. При поступлении изделий в мягкой упаковке первый слой снимают в предбокснике и изделия во внутренней упаковке сразу переносят в бокс.

4.2.9. Посевы на стерильность проводят бактериолог с помощью лаборанта.

5. Посевы на стерильность хирургического инструмента

5.1. Хирургический инструментарий с помощью стерильного пинцета извлекают из бикса или мягкой упаковки и целиком погружают в пробирки с питательными средами. Как исключение, в отдельных случаях, если все простерилизованные инструменты в одной упаковке крупных размеров (иглодержатели, ранорасширители и т.д.), производят смыв с поверхности инструмента стерильной салфеткой, смоченной в стерильном физиологическом растворе или стерильной водопроводной воде и погружают салфетку в пробирку с тиогриколевой средой. Аналогичные смывы с других инструментов засевают в пробирки со средой Хоттингера и Сабуро.

5.2.6. Методика посева на стерильность игл и шприцев.

Для контроля на стерильность отбирают шприцы малой емкости (1,0 или 2,0 мл) в условиях бактериологического бокса, с соблюдением правил асептики погружают в пробирки с питательными средами отдельно цилиндр, поршень, иглы.

При необходимости контроля шприцев большой емкости (10, 20 мл и более) исследование стерильности производят методом смыва, при этом стерильной салфеткой, смоченной в стерильном физиологическом растворе или водопроводной воде, протирают с помощью пинцета внутренние части шприца и погружают салфетку в питательные среды.

5.3. Исследование на стерильность систем переливания крови многоразового использования.

От резинового шланга, ближе к игле отрезают ножницами с помощью пинцета небольшие кусочки (1-2 см) и погружают в пробирки с питательными средами, иглу отдельно погружают в питательные среды.

5.4. Посев на стерильность катетеров, резиновых перчаток и др. изделий из резины и пластикатов.

Контроль стерильности зондов, катетеров, резиновых перчаток и других изделий из резины производят путем полного погружения мелких изделий в питательные среды, от более крупных с помощью стерильного пинцета стерильными ножницами отрезают небольшие кусочки (1-2 см) и погружают в питательные среды.

5.5. Посев на стерильность хирургического шовного материала.

Перед посевом емкость с отобранными образцами шовного материала в предбокснике протирают стерильной марлевой салфеткой, обильно смоченной 6% раствором перекиси водорода, и оставляют на 30 минут. Затем вносят в бокс.

5.5.1. Кетгут. Подготовленный к работе кетгут в операционном блоке хранят в спиртовом растворе йода. Кетгут перед посевом подвергают специальной обработке для нейтрализации и отмывания нейтрализующего раствора. Моток кетгута, приготовленный для исследования, перекладывают стерильным карнцангом или пинцетом в стерильный 10% раствор гипосульфита натрия. Раствор гипосульфита натрия готовят на дистиллированной воде, разливают в пробирки (колбы) по 20-30 мл, стерилизуют текучим паром по 30 минут в продолжении 3 дней. Кетгут выдерживают в растворе гипосульрита в течение 24 часов при комнатной температуре (возможно помутнение раствора за счет выпадения серы), затем перекладывают в пробирки с 20-30 мл стерильной дистиллированной воды, где также выдерживают в течение 24 часов в при комнатной температуре. Непосредственно перед посевом моток кетгута извлекают стерильным пинцетом и перекладывают в стерильную чашку Петри, с помощью пинцета и ножниц его разрезают на мелкие кусочки длиной 1-2 см и раздергивают для прорастания микроорганизмов кетгута.

Посев производят в 2 пробирки с тиогликолевой средой, 2 пробирки со средой Сабуро и 2 пробирки со средой Хоттингера, помещая в каждую пробирку по 4-5 кусочков исследуемого материала.

5.5.2. Шелк. Подготовленный к работе шелк в операционных хранят в спиртовом растворе, поэтому перед посевом шелк (лавсан) помещают на 24 часа в стерильную дистиллированную воду при комнатной температуре. Перед посевом моток шелка (лавсана) перекладывают в стерильные чашки Петри, разрезают на мелкие кусочки длинной 1-2 см. Посев шелка производят так же, как и кетгута.

5.6. Исследование на стерильность аппаратов экстракорпорального кровообращения.

Исследование на стерильность аппарата искусственного кровообращения проводит бактериолог и лаборант лечебно-профилактического учреждения в операционной после асептической уборки аппарата.

Контролю подлежат:

- смыв из аппарата;

- перфузат до перфузии;

- кровь после перфузии.

Стерильный физиологический раствор в количестве не менее 250 мл прогоняют через аппарат, подготовленный к операции, отбирают 100 мл раствора и засевают на питательные среды. Аналогично производят посев пефузата до пефузии и крови после перфузии.

5.7. Посев на стерильность перевязочного материала.

Бинты, ватные шарики, марлевые салфетки, турунды и т.п. отбирают из разных мест бикса стерильным пинцетом. Мелкие изделия целиком погружают в пробирки с питательными средами. От бинтов внутренних частей) и крупных марлевых салфеток с помощью стерильных ножниц отрезают кусочки и погружают в пробирки питательными средами. На каждый вид перевязочного материала используют по 2 пробирки каждой среды.

5.8. Посев на стерильность хирургического белья.

Простерилизованными и фламбированными ножницами (смоченными в спирте и проведенными через пламя горелки) с помощью пинцета от хирургического белья отрезают небольшие кусочки ткани (завязка, внутренние швы и т.п.) и погружают в пробирки (колбы) с питательными средами, по-возможности, не касаясь стенок пробирки (колбы).

6. Учет результатов

Материал стерилен при отсутствии роста во всех посевах.

Материал не стерилен при росте микрофлоры.

7. Бактериологический контроль эффективности обработки кожи
операционного поля и рук хирургов

Смывы с кожи операционного поля и рук хирургов производят стерильными марлевыми салфетками размером 5х5 см, смоченными 2 в растворе нейтрализатора (если таковой имеется) или в физиологическом растворе. Марлевой салфеткой тщательно протирают ладони, околоногтевые и межпальцевые пространства обеих рук. После забора проб марлевую салфетку помещают в широкогорлые пробирки или колбы с раствором нейтрализатора (воды или физиологического раствора) и стеклянными бусами, встряхивают в течение 10 минут, производят отмыв марлевой салфетки. Отмывную жидкость засевают глубинным способом по 0,5 мл на 2 чашки Петри с мясопептонным агаром, а марлевую салфетку - в 0,5% сахарный бульон. Посевы инкубируют при температуре 37 град.С в течение 48 часов.

8. Учет результатов

Кожа и руки стерильны при отсутствии роста микроорганизмов как на твердой, так и на жидкой питательной среде.