Приложение N 1. Методы серологической диагностики трихинеллеза

Приложение N 1

Методы серологической диагностики трихинеллеза.

Реакция связывания комплемента на холоду (РСК)

РСК ставят с антигеном из личинок трихинелл производства ИЭМ Минздрава Белорусской ССР.

Приготовление реактивов. Буфер веронал - мединаловый (рН 7,3 - 7,5). Барбитал (веронал) - 5,75 г. растворяют в 500 - 700 мл горячей дистиллированной воды, прибавляют 85 г. хлористого натрия, 3,75 г. барбитал натрия (мединал), 9,4 мл 0,59 М раствора хлористого магния, 3,3 мл 0,46 М раствора хлористого кальция (или 10% раствор в ампулах) и доводят объем до 2000 мл дистиллированной водой. Хранят буфер в холодильнике. В день постановки реакции готовят рабочий раствор буфера (используется для разведения всех реагентов в реакции) путем разведения исходного буфера в 5 раз дистиллированной водой. Концентрация солей магния и кальция в растворах должна строго соответствовать указанной прописи. Проверить ее проще всего по удельному весу ареометром или урометром. Оба раствора должны иметь удельный вес 1039.

В день постановки реакции исследуемую сыворотку инактивируют в течение 30 мин путем нагревания в водяной бане при 56°С.

Эритроциты барана свежие (хранят в холодильнике не более 3 - 5 дней) или консервированные в растворе Олсвера (2,05 г глюкозы, 0,8 г цитрата натрия, 0,42 г хлористого натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды, рН раствора устанавливают путем добавления лимонной кислоты. Раствор стерилизуют в течение 3-х дней по 20 мин. в кипячей водяной бане и хранят при +4°С). Консервированные эритроциты можно использовать через 4 дня после добавления консерванта в течение месяца. Перед постановкой реакции эритроциты отмывают 3 - 4 раза буфером путем центрифугирования до получения прозрачной надосадочной жидкости без следов гемолиза (в противном случае попользовать эритроциты нельзя). Из осадка эритроцитов готовят 3% взвесь в буфере.

Гемолитическая сыворотка - инактивированная сыворотка кролика, иммунизированного эритроцитами барана (выпускает Московский институт вакцин и сывороток им. Мечникова Минздрава СССР) используется в разведении в 3 раза меньшем по сравнению с указанным на этикетке ампулы. Гемолитическая система. К 3% взвеси эритроцитов добавляют при постоянном помешивании равный объем гемолитической сыворотки, разведенной по утроенному титру. Смесь помещают на 30 мин. в термостат при 37°С. Полученную гемосистему можно использовать в течение суток при хранении при +4°С.

Комплемент - лиофилизированная сыворотка морской свинки. Титрование комплемента проводят перед каждой постановкой реакции, начиная с разведения 1:20, в присутствии антигена, взятого в рабочем разведении. Общий объем смеси - 1,25 мл. Титром комплемента является наименьшее его разведение, дающее полный гемолиз. Рабочая доза комплемента равна двойному титру.

Постановка реакции

Исследуемую инактивированную сыворотку разливают по пробиркам в объеме по 0,25 мл в двукратных разведениях, начиная с 1:5. В каждую пробирку добавляют по 0,25 мл антигена в рабочем разведении. Пробирки выдерживают 15 - 20 мин при комнатной температуре, добавляют в них по 0,25 мл комплемента в рабочей дозе и помещают в холодильник (+4°С) на 18 - 10 часов, а затем в термостат на 15 мин; вновь добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл гемолитической системы и оставляют в термостате (+37°С) в течение 1 часа.

Если за это время в контрольных пробирках гемолиз не наступил, время инкубации следует увеличить и оценку реакции проводить после наступления гемолиза в контрольных пробирках.

Оценка реакции

Оценивают реакцию по четырехкрестовой системе. Конечным титром реакции считают максимальное разведение исследуемой сыворотки, в котором наблюдается задержка гемолиза на ++++ и +++. Реакция с задержкой гемолиза на ++ считается слабо положительной, а на + и - отрицательной.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

РНГА ставят с антигеном из личинок трихинелл производства Белорусского ордена Трудового Красного Знамени НИИ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Белорусской ССР.

Приготовление диагностикума

В сосуд, содержащий 15 - 20 стеклянных бус, помещает 50 - 60 мл крови, взятой у старого барана, и выдерживают, постоянно помешивая, в течение 15 мин для отделения фибрина. Дефибринированную кровь фильтруют через один слой марли, получая таким путем 50%-ую взвесь эритроцитов. К 1 объему этой взвеси добавляют 6 объемов фосфатно-солевого буфера рН 7,2, получая при этом 8% взвесь. Буфер с рН 7,2 готовят 550 мг, 102 мг, 2,125 мг, дистиллированной воды до 250 мл. Полученную взвесь соединяют в равных объемах с 3%-ым раствором формалина (вливая взвесь эритроцитов в формалин) и выдерживают на водяной бане при 37°С 2 - 3 часа, перемешивая каждые 15 мин. Смесь оставляют до следующего дня, центрифугируют, осадок промывают три раза фосфатно-солевым буфером рН 7,2 путем центрифугирования при 2 - 3 тыс. об/мин и добавляют к нему фосфатно-солевой буфер, доводя взвесь эритроцитов до первоначального объема. К взвеси добавляют концентрированный нейтральный формалин в соотношении 0,5 мл на 100 мл взвеси. Хранят при +4°С.

К 0,5 мл плотного осадка формалинизированных эритроцитов отмытых три раза 0,9% раствором хлорида натрия, добавляют 40 мл фосфатно-солевого буфера рН 7,2, а затем равный объем таниновой кислоты в разведении 1/16 000, размешивают и выдерживают 30 мин на водяной бане при 37°С, перемешивая содержимое каждые 10 - 15 мин. Отмывают три раза путем центрифугирования при 2000 об/мин 0,9% раствором хлорида натрия и в образовавшийся после центрифугирования осадок добавляют 40 мл фосфатно-солевого буфера рН 7,2. Формалинизированные и таннизированные эритроциты сенсибилизируют антигеном, добавляя к определенному объему 1,5% взвеси эритроцитов равный объем антигена. Смесь выдерживают 1 час на водяной бане (37°С), помешивая каждые 10 - 15 мин., отмывают три раза путем центрифугирования при 2500 об/мин 0,9% раствором хлорида натрия и в осадок добавляют 40 мл фосфатно-солевого буфера (рН 7,2), содержащего мертиолят в разведении 1/10.000. Полученный диагностикум хранят при 4°С.

Постановка реакции

Реакцию ставят на агглютинационных плексиглазовых плашках. Плашки перед употреблением тщательно промывают ватным тампоном в теплой и холодной воде, споласкивают 3 раза дистиллированной водой и протирают каждую лунку чистой марлей. Исследуемую сыворотку разводят 1/10 1% раствором сыворотки нормального кролика в фосфатно-солевом буфере pH 7,2 с добавлением концентрированного формалина в количестве 0,5 мл на 100 мл сыворотки и инактивируют путем нагревания при 56°С в течение 30 мин. Инактивированную сыворотку адсорбируют эритроцитами барана, добавляя 1 каплю плотного осадка формалинизированных эритроцитов (предварительно отмытых от формалина трехкратным промыванием 0,9% раствором хлорида натрия), и выдерживая 2 часа. Эритроциты отделяют центрифугированием и полученную сыворотку в последовательных двухкратных разведениях с 1/20 до 1/40960, в количестве 0,25 мл, вносят в два ряда лунок на плашке. В лунки первого ряда добавляют по 1 - 2 капли диагностикума, в лунки второго ряда (контроль исследуемой сыворотки) по 1 - 2 капли таннизированных эритроцитов барана. Дополнительные контроли: а) заведомо положительная сыворотка в тех же разведениях + диагностикум; б) заведомо отрицательная сыворотка в разведениях от 1/20 до 1/640 + диагностикум; в) 1%-й раствор нормальной сыворотки кролика на фосфатно-солевом буфере + диагностикум. Плашки хорошо встряхивают для перемешивания ингредиентов и оставляют при комнатной температуре до следующего дня или в термостате при +37°С на 2 часа.

Оценка реакции

Результат учитывают по характеру осадка эритроцитов на дне лунок. Интенсивная (+++) или резко интенсивная (++++) реакция - почти все или все эритроциты склеены на дне лунки, образуя "зонтик"; в центре может сформироваться чуть заметное кольцо из несклеившихся эритроцитов. Средняя интенсивность реакции (++) - на дне лунки осадок из несклеившихся эритроцитов в виде плотного широкого кольца. Слабая интенсивность (+) - большинство эритроцитов не склеилось и осело на дно лунки в виде маленького кольца. Отрицательная (-) эритроциты осели на дно лунки в виде "пуговки" с ровными краями. Положительной считается реакция интенсивностью +++ и ++++, а предельным титром - последнее разведение сыворотки, давшее интенсивность не менее +++. Диагностическим титром считается разведение сыворотки 1/320. Реакция в более низких титрах расценивается как отрицательная, так как иногда наблюдается у лиц с различными другими заболеваниями.