Приложение 1. Метод определения общего содержания небелковых тиолов в ткани печени

Приложение 1
к МР 1.2.0054-11

Метод определения общего содержания небелковых тиолов в ткани печени

П1. Основное оборудование и материалы

П1.1. Микроразмельчитель тканей POLYMIX PX-SR50E, производства "Kinematica AG", Германия или другой с аналогичными параметрами.

П1.2. Центрифуга с охлаждением 3-18К, производства "Sigma", Германия или другая с аналогичными параметрами.

П1.3. Спектрофотометр видимого света на длину волны 412 нм СФ-46 (Россия) или другой с аналогичными параметрами, прошедший метрологическую поверку в установленном порядке.

П1.4. Кюветы кварцевые или стеклянные для спектрофотометрии с длиной хода луча 1 см.

П1.5. Весы лабораторные аналитические (точность мг), отвечающие требованиям ГОСТ 24104-2001.

П1.6. Весы лабораторные (точность мг) отвечающие требованиям ГОСТ 24104-2001.

П.1.7. Бытовой холодильник по ГОСТ 26678-85 с морозильной камерой на температуру до -18°С.

П1.8. Дозаторы жидкости автоматические с одноразовыми наконечниками, емкостью 20-200 , 100-1000 и 1000-5000 , обеспечивающие суммарную погрешность дозирования на уровне %, производства "Eppendorf Research", Германия или другие с аналогичными параметрами;

П1.9. Пробирки центрифужные полиэтиленовые или полипропиленовые, объём 10 .

П1.10. Пробирки стеклянные на объём 10-20 по ГОСТ 25336-82.

П1.11. Колбы мерные на 100, 500 и 1000,0 со шлифом и пробкой ГОСТ 1770-74;

П1.12.Одноразовые полиэтиленовые наконечники для лабораторных дозаторов объемом 10-200 , 100-1000 и 1000-5000 , производства "Eppendorf", Германия или другие с аналогичными параметрами.

П1.13. Штатив для пробирок

П1.14. Дистиллятор электрический ДЭ-4-2, производства ОАО "Тюменский завод медицинского оборудования и инструментов", Россия или другой с аналогичными параметрами.

П2. Реактивы:

П2.1. трис-гидроксиметиламинометан основание (Трис) 98,0% чистоты, производства "Bio-Rad", США или другое с аналогичными параметрами;

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

П2.3. реактив Эллмана (ДТНБ, 5,5'-дитиобис-2-нитробензойная кислота) квалификации "Analytical grade";

П2.3. восстановленный глутатион квалификации "Analytical grade";

П2.4. трихлоруксусная кислота (ТХУ) квалификации ч.д.а или х.ч. или импортный квалификации "Analytical grade".

П2.5. спирт этиловый 96,0% по ГОСТ Р 51652-2000.

П2.6. хлорид калия (KCl) ч.д.а. по ГОСТ 4568-95.

П3. Подготовка проб для анализа

Печень немедленно после получения от животных промывают и перфузируют охлажденным до 0-2°С 1,15% раствором КСl. Все последующие процедуры проводят при температуре не выше +4оС в холодной комнате. Печень просушивают фильтровальной бумагой, измельчают ножницами и продавливают сквозь перфорированную фильеру из нержавеющей стали с отверстиями диаметром ~0,8 мм. Масса полученной при этом навески составляет 2,0 г. Помещают образец и жидкую среду (8 0,154 М КСl на 0,05М Трис/НСl буфере рН 7,4) при соотношении 1:4 (масса:объем) в стеклянную ампулу микроразмельчителя тканей, снабженного тефлоновым пестиком, и ставят ампулу в контейнер. Гомогенизируют в течение 90 с при 1200 об/мин. Жидкая среда в процессе размельчения тканей должна охлаждаться, поэтому пространство между стенками контейнера и ампулой гомогенизатора заполняют льдом. Полученные гомогенаты сливают в стеклянные пробирки и хранят до анализа не более 1 часа при температуре не выше +4°С.

П4. Проведение анализа

Содержание небелковых тиолов печени, представленных у крыс, главным образом, восстановленным глутатионом, определяли согласно с реактивом Эллмана. Аликвоту 1 цельного гомогената печени смешивают в центрифужных пробирках при температуре не выше +2°С с 7 6% ТХУ и через 10 минут центрифугируют при 3000g в течение 20 мин. Супернатант отбирают, тщательно контролируя отсутствие в нём частиц осадка. В случае их наличия центрифугирование повторяют.

Для получения стандартных проб готовят навеску 26,3 мг восстановленного глутатиона, растворяют в 4,5% ТХУ и доводят этим раствором до метки в мерной колбе на 100 . Приготовленный запасной раствор имеет концентрацию 1 . Стандартные растворы для построения стандартного графика готовят из этого раствора согласно прописи:

NN п/п стандартного раствора	Концентрация	Объём запасного раствора глутатиона,	Объём 4,5% ТХУ,
0 (бланк)	0	0	2000
1	20	40	1960
2	40	80	1920
3	80	160	1840
4	100	200	1800
5	200	400	1600
6	400	800	1200

Аликвоты 0,5 стандартных растворов и супернатантов смешивают в стеклянных пробирках с 2 0,4 М Трис-HCl буфера рН 8,9 и 0,05 0,4% раствора ДТНБ в этиловом спирте и через 5 минут определяют оптическую плотность на спектрофотометре против пробы с нулевым стандартом (бланком) при длине волны 412 нм. Концентрацию в супернатанте небелковых тиолов в единицах определяют по величине оптической плотности по стандартному графику в координатах: концентрация глутатиона в стандартных растворах, (ось абсцисс) - оптическая плотность (ось ординат).

Примечание: стандартный график должен быть линейным во всём интервале концентраций глутатиона, построение графика осуществляют по методу наименьших квадратов (линейная регрессия).

Общее содержание небелковых тиолов (в пересчёте на глутатион) в печени рассчитывают по формуле:

T= [GSH]*f*g*M/1000,

где Т - содержание тиолов в печени, мкмоль; [GSH] - концентрация глутатиона в супенратанте, , f - коэффициент разбавления гомогената раствором ТХУ, равный 8, g - кратность гомогената, равная 5, М - масса печени (г), 1000 - коэффициент пересчёта от единиц к единицам мкмоль/г ткани.