Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Приложение 5
к МР 1.2.0054-11
Методы определения активности ферментов антиоксидантной защиты печени
Исследования активностей ферментов рекомендуется проводить на полуавтоматическом биохимическом анализаторе ФП-901, производства "Labsystems OY", Финляндия или другом с аналогичными параметрами. Исследование проводят в цельном гомогенате печени лабораторных животных.
П1. Определение активности глутатионредуктазы осуществляют на основе метода Tilbotsen et al.(1971) в адаптации согласно [1]
Реагенты:
- 50 мМ Трис-НСl (рН 7.6) (реагент 1);
- 4 мМ НАДФН (реагент 2);
- 3.7 мМ окисленный глутатион (реагент 3);
- гомогенат печени (см. приложение 1 пункт П3) в 50 мМ трис-НСl (рН 7.6) в соотношении 1:20
Приготовление растворов:
раствор 1: буферно-коферментная смесь: готовят перед измерением путем смешения 60 реагента 1 и 1
реагента 2.
Реакционная смесь:
0.45 раствора 1 смешивают с 50
гомогената, реакцию запускают добавкой 100
реагента 3.
Режимы измерения:
время задержки - 15 с, время измерения -120 с, кинетический режим, температура 37°С, длина волны нм. Фоновая реакция - вместо гомогената аликвота
. Расчет : активность ГР (
эр) =
, где dА - скорость возрастания оптической плотности (ед о.п./с) соответственно для опытной пробы и бланка (без добавления гомогената) р = разведение пробы, k -коэффициент для анализатора используемого типа.
П2. Определение активности глутатионпероксидазы в гомогенатах печени осуществляют на основе метода Mille ( 1959) в модификации [2]
Реагенты:
1. 67 мМ K,Na-фосфатный буфер (рН 7.0) с 3 мМ , 0,1% тритоном X-100, 0,01% азидом натрия
;
2. 4 мМ НАДФН;
3. 8.3 мМ восстановленный глутатион;
4. глютатионредуктаза дрожжей Sigma (активность не менее 8 );
5. трет-бутиловая перекись в этаноле (70%) готовый препарат производства "Sigma", США или аналогичная;
6. гомогенат печени.
Приготовление растворов:
раствор 1: 50 реагента 1 смешивают с 1
реагента 2 и 1
реагента 4 непосредственно перед измерением;
реакционная смесь: 0,49 раствора 1 смешивают с 20
гомогената печени, добавляют 75
реагента 5, реакция запускают добавлением 50
реагента 3.
Режимы измерения:
время задержки - 20 с, время измерения - 120 с, кинетический режим, температура 37°С, длина волны нм. Бланк - вместо гомогената аликвота
.
Расчет: активность ГП (мкмоль/мин. эр) =
, где dА - скорость возрастания оптической плотности (ед о.п./с) в опытной пробе и бланке соответственно; р = разведение пробы, k - коэффициент, подобранный для анализатора используемого типа.
П3. Определение активности каталазы в гомогенатах печени осуществляют на основе метода Oshino et al. (1987) в модификации [3]
Принцип метода основан на использовании алкогольдегидрогеназной "ловушки" по следующей схеме:
Реагенты:
1. 67 мМ Na-фосфатный буфер (рН 7.4);
2. 36.8 мМ НАДН;
3. алкогольдегидрогеназа дрожжей, производства "Serva", Германия или аналогичная ( активность не менее 36.8 );
4. в этаноле (0,3% р-р
в 70% этаноле);
5. гомогенат печени
Приготовление растворов: раствор 1: 50 реагента 1 смешивают с 1
реагента 2 и 1
реагента 3 непосредственно перед измерением.
Реакционная смесь:
0,49 раствора 1 смешивают с 10
гомогената печени. Старт реакции осуществляют добавкой 50
реагента 4. Бланк - вместо гомогената аликвота
.
Режимы измерения:
- время задержки - 20 с, время измерения -120 с, кинетический режим, температура 37°С, длина волны нм.
Расчет для ФП-901: Активность каталазы ( эр) =
, где dА - скорость изменения оптической плотности (ед.о.п./с) в опытной пробе и бланке соответственно; р = разведение пробы, k - коэффициент, подобранный для анализатора используемого типа.
П4. Определение активности супероксиддисмутазы осуществляют на основе метода Niashikimi et al. (1972) в модификации [3]
Реагенты:
1. 2 мМ рН 8.3;
2. 0,05 мМ нитросиний тетразолий;
3. 2,5 мкМ НАДН;
4. 25 мкМ феназинметосульфат;
5. гомогенат ткани печени.
Примечения: Реагенты 1, 3 и 4 готовятся непосредственно перед измерением.
Приготовление растворов:
Раствор 1: 50 реагента 1 смешивают с 7,5
реагента 2 и 2
реагента 3 непосредственно перед измерением.
Реакционная смесь: 0,32 раствора 1 смешивают с 20
гомогената. Старт реакции осуществляется добавкой 50
реагента 4, разведенного в 10 раз.
Режимы измерения: время задержки - 10 с, время измерения - 180 с, кинетический режим, температура 25°С, длина волны нм, параллельный режим для измерения опытной и фоновой проб. Фоновая проба (бланк) - вместо гомогената аликвота
.
Расчет для ФП-901: активность СОД (усл.ед/мин) = , где A - оптическая плотность, соответственно в опытной пробе и бланке, р - разведение пробы, k - коэффициент, подобранный для анализатора используемого типа.
П5. Содержание диеновых коньюг
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.