Приложение 5. Методы определения активности ферментов антиоксидантной защиты печени

Приложение 5
к МР 1.2.0054-11

Методы определения активности ферментов антиоксидантной защиты печени

Исследования активностей ферментов рекомендуется проводить на полуавтоматическом биохимическом анализаторе ФП-901, производства "Labsystems OY", Финляндия или другом с аналогичными параметрами. Исследование проводят в цельном гомогенате печени лабораторных животных.

П1. Определение активности глутатионредуктазы осуществляют на основе метода Tilbotsen et al.(1971) в адаптации согласно [1]

Реагенты:

- 50 мМ Трис-НСl (рН 7.6) (реагент 1);

- 4 мМ НАДФН (реагент 2);

- 3.7 мМ окисленный глутатион (реагент 3);

- гомогенат печени (см. приложение 1 пункт П3) в 50 мМ трис-НСl (рН 7.6) в соотношении 1:20

Приготовление растворов:

раствор 1: буферно-коферментная смесь: готовят перед измерением путем смешения 60 реагента 1 и 1 реагента 2.

Реакционная смесь:

0.45 раствора 1 смешивают с 50 гомогената, реакцию запускают добавкой 100 реагента 3.

Режимы измерения:

время задержки - 15 с, время измерения -120 с, кинетический режим, температура 37°С, длина волны нм. Фоновая реакция - вместо гомогената аликвота . Расчет : активность ГР ( эр) = , где dА - скорость возрастания оптической плотности (ед о.п./с) соответственно для опытной пробы и бланка (без добавления гомогената) р = разведение пробы, k -коэффициент для анализатора используемого типа.

П2. Определение активности глутатионпероксидазы в гомогенатах печени осуществляют на основе метода Mille ( 1959) в модификации [2]

Реагенты:

1. 67 мМ K,Na-фосфатный буфер (рН 7.0) с 3 мМ , 0,1% тритоном X-100, 0,01% азидом натрия ;

2. 4 мМ НАДФН;

3. 8.3 мМ восстановленный глутатион;

4. глютатионредуктаза дрожжей Sigma (активность не менее 8 );

5. трет-бутиловая перекись в этаноле (70%) готовый препарат производства "Sigma", США или аналогичная;

6. гомогенат печени.

Приготовление растворов:

раствор 1: 50 реагента 1 смешивают с 1 реагента 2 и 1 реагента 4 непосредственно перед измерением;

реакционная смесь: 0,49 раствора 1 смешивают с 20 гомогената печени, добавляют 75 реагента 5, реакция запускают добавлением 50 реагента 3.

Режимы измерения:

время задержки - 20 с, время измерения - 120 с, кинетический режим, температура 37°С, длина волны нм. Бланк - вместо гомогената аликвота .

Расчет: активность ГП (мкмоль/мин. эр) = , где dА - скорость возрастания оптической плотности (ед о.п./с) в опытной пробе и бланке соответственно; р = разведение пробы, k - коэффициент, подобранный для анализатора используемого типа.

П3. Определение активности каталазы в гомогенатах печени осуществляют на основе метода Oshino et al. (1987) в модификации [3]

Принцип метода основан на использовании алкогольдегидрогеназной "ловушки" по следующей схеме:

Реагенты:

1. 67 мМ Na-фосфатный буфер (рН 7.4);

2. 36.8 мМ НАДН;

3. алкогольдегидрогеназа дрожжей, производства "Serva", Германия или аналогичная ( активность не менее 36.8 );

4. в этаноле (0,3% р-р в 70% этаноле);

5. гомогенат печени

Приготовление растворов: раствор 1: 50 реагента 1 смешивают с 1 реагента 2 и 1 реагента 3 непосредственно перед измерением.

Реакционная смесь:

0,49 раствора 1 смешивают с 10 гомогената печени. Старт реакции осуществляют добавкой 50 реагента 4. Бланк - вместо гомогената аликвота .

Режимы измерения:

- время задержки - 20 с, время измерения -120 с, кинетический режим, температура 37°С, длина волны нм.

Расчет для ФП-901: Активность каталазы ( эр) = , где dА - скорость изменения оптической плотности (ед.о.п./с) в опытной пробе и бланке соответственно; р = разведение пробы, k - коэффициент, подобранный для анализатора используемого типа.

П4. Определение активности супероксиддисмутазы осуществляют на основе метода Niashikimi et al. (1972) в модификации [3]

Реагенты:

1. 2 мМ рН 8.3;

2. 0,05 мМ нитросиний тетразолий;

3. 2,5 мкМ НАДН;

4. 25 мкМ феназинметосульфат;

5. гомогенат ткани печени.

Примечения: Реагенты 1, 3 и 4 готовятся непосредственно перед измерением.

Приготовление растворов:

Раствор 1: 50 реагента 1 смешивают с 7,5 реагента 2 и 2 реагента 3 непосредственно перед измерением.

Реакционная смесь: 0,32 раствора 1 смешивают с 20 гомогената. Старт реакции осуществляется добавкой 50 реагента 4, разведенного в 10 раз.

Режимы измерения: время задержки - 10 с, время измерения - 180 с, кинетический режим, температура 25°С, длина волны нм, параллельный режим для измерения опытной и фоновой проб. Фоновая проба (бланк) - вместо гомогената аликвота .

Расчет для ФП-901: активность СОД (усл.ед/мин) = , где A - оптическая плотность, соответственно в опытной пробе и бланке, р - разведение пробы, k - коэффициент, подобранный для анализатора используемого типа.

П5. Содержание диеновых коньюгатов (ДК) в гомогенатах печени определяют с помощью классического спектрофотометрического метода Placer (1968) в модификации Гаврилова и др. [4]

0,2 гомогената вносят в пробирки с плотной крышкой и добавляют 2 чисто перегнанной смеси изопропанол: гептан (1:1), (v/v). Смесь встряхивают в течение 20-30 минут и добавляют 0,5 НСl (рН = 2), после чего еще раз встряхивают 2 мин и добавляют 1 чисто перегнанного гептана, после чего встряхивают еще 10-15 мин. Примерно через 1 час верхнюю фазу отбирают и фотометрируют при 232 нм против контрольной пробы, где вместо пробы взято 0,2 . Коэффициент экстинкции .

П6. Содержание ТБК - продуктов (малоновый диальдегид) в гомогенате печени определяют по методу Mihara et al. (1980). [5]

0,2 плазмы крови смешивают с 2 1,4% (об/об) ортофосфорной кислоты и 1 0,5% тиобарбитуровой кислоты. Смесь инкубируют в кипящей бане 45 минут, после чего охлаждают и добавляют 2 н-бутанола. Пробирки тщательно встряхивают до образования белой суспензии, после чего центрифугируют при 4000g 20 минут. Верхнюю фазу фотометрируют против контрольной пробы при 532 нм - 570 нм. Коэффициент экстинкции .

П7. Рекомендуемая литература

1. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А. Оптимизация определения активности глутатионредуктазы эритроцитов человека на полуавтоматическом анализаторе// Вопр.мед.химии.- 1994.- N2.- С.59-61.

2. Мальцев Г.Ю.,Тышко Н. В. Методы определения содержания глютатиона и активности глутатионпероксидазы в эритроцитах// Гигиена и санитария.- 2002.- N2.- С. 69-72

3. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа// Вопр. мед. химии.- 1994.- N2.- С. 56-58.

4. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови// Лаб. дело, -1983.- N.3 -С. 33- 35

5. Mihara M., Uchiyama M.,Fukuzawa K. Thiobarbituric acid value on fresh homogenate of rat as a parameter of lipid peroxidation in aging , CCl4 intoxication and vitamin E deficiency// Biochem.Med.-1980.- V.23, N 3.- Р.302-311.