Приложение С. Бруцеллез

Приложение С*(81)

Бруцеллез

1. Идентификация возбудителя

Проявление модифицированных кислотоустойчивых или иммуноспецифических колоний микроорганизмов типа Brucella в материалах аборта, выделениях из влагалища или в молоке является косвенным доказательством бруцеллеза, особенно при результатах серологических исследований. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) обнаруживает дополнительные признаки проявления заболевания.

Во всех возможных случаях носитель Brucella spp. должен быть выделен с использованием простых или селективных методов из маточных выделений, выкидышей, влагалищных выделений, секреций вымени или других тканей, таких органов как лимфатические узлы, мужские и женские репродуктивные органы. 

После выделения возбудителя это следует подтвердить лизисом бактериофага и/или окислительным метаболическим тестом согласно культурным, биохимическим и серологическим критериям. ПЦР может содержать оба метода - дополнительный метод и биотипирование, основанное на геномных последовательностях. 

Используемые методы и приемы, их стандартизация и интерпретация результатов должны соответствовать положениям Руководства по Диагностическому тестированию OIE и вакцинации сухопутных животных, 6 издание 2008 года, Глава 2.4.3 (бруцеллез крупного рогатого скота), Глава 2.7.2. (бруцеллез коз и овец) и Глава 2.8.5 (бруцеллез свиней). 

2. Иммунологические исследования

2.1.Стандарты

2.1.1. Brucella abortus биовар 1 штамм Weybridge N 99 или штамм USDA 1119-3 должны использоваться для приготовления всех антигенов роз-бенгал теста (RBT - тест на определение бруцеллеза), реакции агглютинации (SAT), реакции связывания комплемента (CFT), реакции агглютинации с молочной сывороткой (MRT).

2.1.2. Стандартная референс-сыворотка для тестов RBT, SAT, CFT и MRT должна соответствовать международному перечню эталонов сыворотки крови OIE (OIEISS), ранее второй международный перечень видов иммунной сыворотки против бруцеллеза Всемирной организации здравоохранения (ISAbS).

2.1.3.Стандартные образцы сыворотки для иммуноферментного твердофазного анализа (ELISAs) должны быть:

- OIEISS

- слабоположительный OIE ELISA стандарт сыворотки (),

- сильно положительный OIE ELISA стандарт сыворотки (),

- отрицательный OIE ELISA стандарт сыворотки ().

2.1.4. Стандартные эталоны сыворотки для теста поляризации флюоресценции (FPAs) должны быть:

- слабоположительный OIE ELISA стандарт сыворотки (),

- сильно положительный OIE ELISA стандарт сыворотки (),

- отрицательный OIE ELISA стандарт сыворотки ().

2.1.5. Стандартные эталоны сыворотки, обозначенные в пунктах 2.1.3. и 2.1.4., находятся в лаборатории Сообщества по исследованию бруцеллеза или в Ветеринарном Лабораторном Агентстве (VLA), Вейбридж, Великобритания.

2.1.6. OIEISS, , и - основные международные стандарты, на основе которых разрабатываются дополнительные национальные стандарты сыворотки (рабочие стандарты) для каждого вида исследований, обозначенных в пункте 2.1.1.

2.2. Иммуноферментный твердофазный анализ (ELISAs) или другие анализы связывания для определения бруцеллеза крупного рогатого скота в сыворотке крови или молоке

2.2.1 Материалы и реагенты

Используемая техника и интерпретация результатов должны быть утверждены в соответствии с принципами Главы 1.1.4 Руководства OIE по Диагностическому тестированию и вакцинации сухопутных животных, 6 издание 2008 года и должны быть основаны как минимум на лабораторных и диагностических исследованиях. 

2.2.2. Стандартизация исследований

2.2.2.1. Стандартизация процедуры исследования единичных образцов сыворотки:

(а) образец, разбавленный в пропорции 1/150*(82) OIEISS или в отношении 1/2 , 1/64 приготовленный на сыворотке с отрицательным показателем, дает положительную реакцию;

(b) предварительно разведенный образец 1/600 OIEISS или 1/8 или 1/64 , созданный на основе отрицательной сыворотки, должен показывать отрицательную реакцию;

(с) должны всегда давать отрицательную реакцию.

2.2.2.2. Стандартизация процедуры испытаний для групп проб сыворотки:

(а) предварительно разведенный образец в соотношении 1/150 OIEISS или 1/2 или 1/16 , готовится на основе отрицательной сыворотки, потом снова разводится в отрицательной сыворотке по количеству образцов, дает положительную реакцию;

(b) всегда реагирует отрицательно;

(с) тест должен соответствовать назначению - выявление признаков инфекции в единичном животном группы, образцы сыворотки которого были сгруппированы.

2.2.2.3. Стандартизация процедуры испытаний для групп образцов молока или сыворотки:

(а) предварительно разведённый образец в соотношении 1/1 000 OIEISS, 1/16 или 1/125 , готовится на основании отрицательной сыворотки (или отрицательных групп сывороток) и снова разбавляются 1/10 отрицательным молоком, при этом будет положительная реакция;

(b) разбавляют 1/10 в отрицательном молоке, всегда дает отрицательную реакцию;

(с) тест должен соответствовать назначению - выявление признаков инфекции в единичном животном группы, образцы сыворотки которого были сгруппированы. 

2.2.3. Условия использования ELISA для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота:

2.2.3.1. При использовании одобренных условий для ELISA, изложенных в пунктах 2.2.2.1 и 2.2.2.2, на образцах сыворотки, диагностическая чувствительность ELISA должна быть равна или больше, чем RBT или CFT с учетом эпидемиологической ситуации, в которых она работает.

2.2.3.2. При использовании одобренных условий для ELISA, изложенных в пункте 2.2.2.3, на группах проб молока, диагностическая чувствительность ELISA должна быть равной или большей, чем MRT, принимая во внимание не только эпидемиологическую ситуации, но и условия нормальной ситуации и самый худший прогноз.

2.2.3.3. Если ELISA используется для целей сертификации в соответствии со Статьей 6(1) или для установления и сохранения статуса стада в соответствии с Приложением А (II) (10), группировка образцов сыворотки должна осуществляться таким образом, что результаты испытаний могли идентифицировать с отдельным животным в группе без особых проблем. Любой подтверждающий тест должен проводиться на образцах сыворотки, взятых от отдельных животных.

2.2.3.4. Тест ELISAs может проводиться на образце молока, взятом из молока собранного на ферме по крайней мере от 30% дойных коров. Для использования такого метода должны быть приняты меры для того, чтобы убедиться, что образцы, принятые к рассмотрению, несомненно, связаны с отдельными животными, от которых было получено молоко. Любой подтверждающий тест должен проводиться на образцах сыворотки, взятых из отдельных животных.

2.3. Реакция связывания комплемента

2.3.1. Антиген представляет собой суспензию бактерий в фенол-солевом растворе (NaCl)

0,85% (m/v) и фенола в 0,5% (v/v)) или в верональном буфере. Антигены могут быть доставлены в концентрированном виде при условии, что коэффициент разбавления, которые будут использоваться, указан на этикетке. Антиген должен храниться при температуре 4°C, при этом замораживать его нельзя.

2.3.2. Сыворотки должны быть инактивированы следующим образом:

- бычья сыворотка: от 56 до 60°C в течение 30 - 50 минут,

- свиная сыворотка: 60°C в течение 30 - 50 минут.

2.3.3. В целях осуществления подлинной реакции во время процедуры испытаний, необходимо использовать дозы выше, чем минимум, необходимый для полного гемолиза.

2.3.4. При проведении теста связывания комплемента должны быть осуществлены следующие контрольные меры:

(а) предотвращение дополнительного влияния на сыворотку;

(b) контроль антигена;

(c) контроль сенсибилизированных эритроцитов;

(d) контроль комплемента;

(e) контроль с помощью положительной сыворотки в начале реакция;

(f) контроль специфичности реакции с помощью отрицательной сыворотки.

2.3.5. Расчет результатов

OIEISS содержит 1 000 международных единиц CFT (ICFTU) на мл. Если таким методом тестируется OIEISS, то результат дается в виде титра (т.е. максимально процент разбавления OIEISS дает 50% гемолиза, ). Результат теста исследуемой сыворотки в титре (), должен быть выражен в ICFTU на мл. Для того чтобы преобразовать титры в ICFTU, показатель (F) неизвестной исследуемой сыворотки можно вычислить по следующей формуле:

и содержание международных единиц CF на мл тестируемой сыворотки () по формуле:

2.3.6. Интерпретация результатов

Сыворотка, содержащая 20 или более ICFTU на мл, считается положительной.

2.4. Реакция агглютинации с молочной сывороткой (MRT)

2.4.1. Антиген представляет собой суспензию бактерий в фенол-солевом растворе (NaCl 0,85% (m/v) и 0,5% фенола (v/v)), окрашенную гематоксилином.

Антиген должен храниться при температуре 4°C, а не подвергаться заморозке.

2.4.2. Чувствительность антигена должна быть стандартизирована по отношению к OIEISS таким образом, чтобы антиген вызывал положительную реакцию при пропорции разбавления 1/500 OIEISS в сыворотке с отрицательным показателем, в то время как пропорция разбавления 1/1000 должна иметь отрицательный результат.

2.4.3. Реакция агглютинации с молочной сывороткой должна быть проведена на всех образцах сыворотки, имеющихся на ферме.

2.4.4. Пробы сыворотки нельзя замораживать, нагревать или подвергать сильной тряске.

2.4.5. Исследование должно быть осуществлено с использованием одного из следующих методов:

- столб образца не менее 25 мм по высоте и по объему сыворотки 1 мл, в образце должно содержаться 0,03 мл или 0,05 мл одного из стандартизированных окрашенных антигенов;

- столб образца не менее 25 мм по высоте и по объему сыворотки 2 мл, в образце должно содержаться 0,05 мл одного из стандартизированных окрашенных антигенов;

- при объеме сыворотки в 8 мл, при доле стандартизированных окрашенных антигенов в 0,08 мл. 

2.4.6. Смесь сыворотки и антигенов должна быть инкубирована при 37°С в течение 60 минут вместе с положительными и отрицательными рабочими образцами. Последующие 16 - 24-часовые инкубации при температуре 4°С увеличивают сенситивность исследования.

2.4.7. Интерпретация результатов:

(а) отрицательная реакция: окрашивание сыворотки, обесцвечивание жирового слоя;

(b) положительная реакция:

- одинаково окрашивание сыворотки и жирового слоя, или

- обесцвечивание сыворотки и жирового слоя.

2.5. Буферное исследование на наличие антигенов Brucella (роз-бенгал тест (RBT)).

2.5.1. Антиген представляет собой бактериальную суспензию в буферном растворителе антигенов Brucella при рН , окрашенном с использованием бенгальского розового пигмента. Антиген должен поставляться готовым к использованию и храниться при температуре 4°C, не подвергаясь заморозке.

2.5.2. Антиген должен быть подготовлен независимо от клеточной концентрации, но его чувствительность должна быть стандартизирована по отношению к OIEISS таким образом, чтобы антиген вызывал положительную реакцию сыворотки при разбавлении 1/45 и отрицательную реакцию при соотношении 1/55.

2.5.3. RBT осуществляется в следующем порядке:

(а) сыворотка (20-30 ) смешивается с равным объемом антигена на белой керамической или эмалированной пластинке, чтобы получился участок около 2 см в диаметре. Полученную смесь необходимо осторожно потрясти в течение четырех минут при температуре окружающей среды, а затем при хорошем освещении исследовать агглютинацию;

(b) автоматизированный метод может быть использован, но должен быть, по крайней мере также точен, как и ручной метод.

2.5.4. Интерпретация результатов

Любые видимые реакции считается положительным, если не наблюдалось чрезмерное высыхание по краям.

Положительные и отрицательные рабочие образцы должны быть включены в каждую серию тестов.

2.6. Реакция агглютинации (SAT)

2.6.1. Антиген представляет собой суспензию бактерий в фенол-солевом растворе (NaCl 0,85% (m/v) и 0,5% фенола (v/v)).

Не следует использовать формальдегид.

Антигены могут быть доставлены в концентрированном виде при условии, что коэффициент разбавления, который будет использоваться, указан на этикетке. EDTA может быть добавлена в суспензию антигена до 5 мМ для уменьшения количества ложных положительных результатов реакции агглютинации. Соответственно, рН 7,2 суспензии антигена должен быть скорректирован.

2.6.2. OIEISS содержит 1000 международных единиц агглютинации.

2.6.3. Антиген должен быть подготовлен независимо от клеточной концентрации, но его чувствительность должна быть стандартизирована по отношению к OIEISS таким образом, чтобы антиген вызывал либо 50% агглютинации с нейтрализующим титром сыворотки при соотношении от 1/600 от 1/1000, либо 75% агглютинации с нейтрализующим титром сыворотки при соотношении от 1/500 от 1/750. 

Также может быть целесообразно сравнить реакционные способности новых и ранее стандартизированных партий антигена с использованием шкалы определения сыворотки.

2.6.4. Исследования должны проводиться либо в пробирках, либо на микропланшетах. Смесь антигена и сыворотки разведения должны быть инкубированы в течение 16 - 24 часов при температуре 37°C.

По крайней мере три раствора должны быть подготовлены для каждой сыворотки. Растворы исследуемой сыворотки должны быть сделаны таким образом, чтобы положительный результат был в средней пробирке (то же самое для микропланшетного метода).

2.6.5. Интерпретация результатов:

Уровень Brucella агглютинации в сыворотке должна быть выражена в международных единицах на мл.

Сыворотку, содержащую 30 или более МЕ на мл, следует считать положительной.

2.7. Анализ флуоресцентной поляризации (FPA)

2.7.1. FPA может быть выполнен в стеклянных пробирках или на планшетах 96 формата.

Используемая техника, ее стандартизация и интерпретация результатов должны соответствовать положениям Главы 2.4.3 (бруцеллез крупного рогатого скота) из Руководства OIE по диагностическим тестам и вакцинации наземных животных, шестое издание, 2008 г.

2.7.2. Стандартизация теста

FPA должен быть стандартизирован таким образом, чтобы:

(а) и последовательно давали положительные результаты;

(b) раствор при соотношении 1/8 или 1/64 , компенсированный отрицательной сывороткой (или в отрицательном пуле сывороток), всегда давали отрицательную реакцию;

(с) всегда дает отрицательную реакцию.

Следующие виды сывороток должны быть включены в каждую партию тестов: резко-положительная, слабоположительная, отрицательная рабочая сыворотки (стандартизированная согласно OIE ELISA стандартных сывороток).

3. Дополнительные испытания

3.1. Кожный тест на бруцеллез (BST)

3.1.1. Условия использования BST

(а) Кожный тест на бруцеллез не должен использоваться для целей сертификации в сфере торговли внутри Сообщества.

(b) Кожный тест на бруцеллез является одним из наиболее специфических тестов для выявления бруцеллеза у непривитых животных, однако диагноз не должен быть поставлен только лишь на основании положительных интрадермальных реакций.

(с) животные, которые имели отрицательную реакцию в одном серологическом испытании, определенном в настоящем Приложении, и показали положительную реакцию на данный тест, должны рассматриваться как потенциально зараженные.

(d) животные, которые имели отрицательную реакцию в одном серологическом испытании, определенном в настоящем Приложении, могут пройти кожный тест на бруцеллез для подтверждения результатов серологических испытаний, особенно если в стаде, не зараженном бруцеллезом, не могут быть исключены перекрестные реакции с антителами против других бактерий. 

3.1.2. Испытание должно проводиться с использованием стандартизированных и определенных препаратов антигена бруцеллеза, которые не содержат антигенов гладких липополисахаридов (LPS), так как это может вызвать неспецифические воспалительные реакции или помешать серии серологических тестов.

Требования к производству бруцеллина должны соответствовать Разделу C1 Главы 2.4.3 в Руководстве OIE по диагностическим тестам и вакцинации наземных животных, шестое издание, 2008 г.

3.1.3. Процедура испытаний

3.1.3.1. Аллерген бруцеллеза объемом 0,1 мл вводят внутрикожно в подхвостовую складку, паховую область, или в области шеи.

3.1.3.2. Результаты тестирования появятся в течение 48 - 72 часов.

3.1.3.3. Толщина кожи в месте инъекции должна быть измерена с помощью штангенциркуля с нониусом перед инъекцией и при повторном тестировании.

3.1.3.4. Интерпретация результатов:

Сильная реакция легко узнаваема по местному отеку и уплотнению. Утолщение кожи от 1 до 2 мм считается положительной реакцией в таком тесте.

3.2. Конкурентный гетерогенный иммуноферментный анализ (cELISA)

3.2.1. Условия использования cELISA

сELISA не должен использоваться для целей сертификации в сфере торговли внутри Сообщества. Животные, которые имели отрицательную реакцию в одном серологическом испытании, определенном в настоящем Приложении, могут пройти конкурентный гетерогенный иммуноферментный анализ (cELISA) для подтверждения результатов серологических испытаний, особенно если в стаде, официально не зараженном бруцеллезом, перекрестные реакции с антителами против других бактерий не могут быть исключены, или для устранения реакции из-за остаточных антител при вакцинации S19.

3.2.2. Процедура испытаний

Испытания должны проводиться в соответствии с положениями Раздела B (2) Главы 2.4.3 Руководства OIE по диагностическим тестам и вакцинации наземных животных, шестое издание, 2008 г.

4. Национальные исследовательские лаборатории

4.1. Задачи и обязанности

Национальные исследовательские лаборатории, назначенные в соответствии со Статьей 6a, несут ответственность за:

(а) подтверждение результатов исследований, демонстрирующих надежность методов, используемых в государстве-члене ЕС;

(b) определение максимального числа образцов для набора ELISA;

(c) стандартизацию образцов сыворотки в национальных масштабах ("рабочие стандарты") по отношению к основным международным стандартам сывороток, указанных в параграфе 2.1;

(d) проверка качества всех антигенов и наборов ELISA, используемых в государстве-члене ЕС;

(е) сотрудничество в рамках Объединения национальных лабораторий по исследованию бруцеллеза ЕС.