Глава II. Тестирование на определение энзоотического бычьего лейкоза

Глава II
Тестирование на определение энзоотического бычьего лейкоза

Тесты на определение энзоотического лейкоза крупного рогатого скота осуществляется при помощи теста иммунодиффузии в геле агара (AGID) в условиях, описанных в разделах А и B или иммуноферментного анализа (ELISA) при условиях, описанных в разделе С. Тест иммунодиффузии в геле агара может быть использован только для испытания отдельных образцов. Если результаты испытаний вызывают сомнения, дополнительная проверка осуществляется с помощью теста иммунодиффузии в геле агара.

AGID и ELISA должны быть стандартизированы по отношению к сыворотке E05, которая должна являться официальным стандартом сыворотки на территории Сообщества, поставляемые:

Институтом Фридриха Леффлера

Федеральный научно-исследовательский институт по охране здоровья животных

Справочная лаборатория OIE по энзоотическому лейкозу крупного рогатого скота (EBL)

Зюдуфер 10

17493 Грайфсвальд - остров Римс

Германия.

А. Тест иммунодиффузии в геле агара для определения энзоотического лейкоза крупного рогатого скота

1. Антиген, который будет использоваться в тесте должен содержать вирус бычьего лейкоза гликопротеин. Антиген должен быть стандартизирован относительно сыворотки E05.

2. Государственные институты, национальные исследовательские лаборатории или официальные институты, назначенные в соответствии со Статьей 6a, занимающиеся координацией стандартов и методов диагностики тестов для определения энзоотического лейкоза крупного рогатого скота, должны быть ответственными за стандартизацию рабочего антигена лаборатории относительно сыворотки E05.

3. Стандартные антигены, используемые в лаборатории, должны подтверждаться по крайней мере раз в год в государственных институтах, национальных исследовательских лабораториях или официальных институтах, назначенных в соответствии со Статьей 6a, на соответствие стандарту сыворотки E05. Помимо такой стандартизации антиген при использовании может быть скорректирован в соответствии с методом, описанным в Разделе B.

4. Реагенты испытаний должны состоять из:

(а) антигена: антиген должен содержать конкретный гликопротеин вируса энзоотического бычьего лейкоза, который стандартизирован в отношении сыворотки E05;

(b) тест-сыворотки;

(с) исследованной положительной контроль-сыворотки;

(d) геля агара:

- 0,8% агара,

- 8,5% NaCl,

- 0,05 М Трис-буфера, рН 7,2,

- 15 мл агара должны быть помещены в чашу Петри диаметром 85 мм, в результате чего слой агара должен стать 2,6 мм.

5. В тестовом образце агара нужно сделать семь сухих лунок до дна пластины; в образце должно быть одно центральное отверстие и шесть лунок вокруг него.

Диаметр центральной лунки: 4 мм

Диаметр внешних лунок: 6 мм

Расстояние между центральной и внешними лунками: 3 мм

6. Центральная лунка должна быть заполнена стандартным антигеном. Внешние лунки 1 и 4, описанные в B.3, заполняются известной положительной сывороткой; лунки 2, 3, 5 и 6 с тест-сывороткой. Лунки должны быть заполнены до исчезновения мениска. 

7. Необходимое количество веществ:

- Антиген: 32 мкл,

- Контроль-сыворотка: 73 мкл,

- тест-сыворотка: 73 мкл.

8. Инкубационный период - 72 часа при комнатной температуре (от 20 до 27°C) в закрытой влажной камере.

9. Результаты теста проявляются через 24 и 48 часов, но конечный результат будет только по истечении 72 часов:

(а) тест-сыворотка имеет положительный результат, если она образует линию преципитации с антигеном вируса бычьего лейкоза крупного рогатого скота (BLV) и полностью совпадает с контрольной сывороткой;

(b) тест-сыворотка является отрицательной, если она не образует осадков с антигеном BLV и если она не совпадает со шкалой контрольной сыворотки;

(c) реакция не может считаться удовлетворительной, если:

(i) показания шкалы тест-сыворотки совпадают с контрольной сывороткой относительно лунки с антигеном BLV без образования осадка с антигеном;

(ii), если результат не может быть определен как однозначно отрицательный или как однозначно положительный.

При отсутствии результатов реакции тест может быть повторен с использованием концентрированной сыворотки. 

10. Любая другая конфигурация лунок или же другой образец можно использовать с целью установления, что в сыворотке E05, разведенной в пропорции 1:10 в сыворотке с отрицательной реакцией, могут быть обнаружены положительные реакции.

B. Метод стандартизации антигена

1. Требуемые растворы и материалы:

(а) 40 мл 1,6% агарозы в 0,05 буфере М Tris/HCl , рН 7,2 с 8,5% NaCl;

(b) 15 мл сыворотки бычьего лейкоза, содержащей антитела вируса бычьего лейкоза - гликопротеины, разбавить в соотношении 1:10 в 0,05 буфере М Tris/HCl, рН 7,2 с 8,5% NaCl;

(с) 15 мл сыворотки бычьего лейкоза, содержащей антитела вируса бычьего лейкоза - гликопротеины, разбавить в соотношении 1:5 в 0,05 буфере М Tris/HCl, рН 7,2 с 8,5% NaCl;

(d) четыре пластиковые чаши Петри диаметром 85 мм;

(е) чаша диаметром от 4 до 6 мм;

(f) стандартизированный антиген;

(g) антиген, который должен быть стандартизирован;

(h) водяная баня (56 ° C).

2. Процедура:

Растворите агарозу (1,6%) в буфере Tris/HCl, аккуратно нагрейте до 100°C. Поставьте на водяную баню 56°С примерно на 1 час. Кроме того, разместите растворы сыворотки лейкоза крупного рогатого скота на водяную баню такой же температуры.

Теперь смешайте 15 мл 56°C раствора агарозы и 15 мл сыворотки бычьего лейкоза (1:10), быстро встряхните и налейте по 15 мл в каждую из двух чаш Петри. Повторите эту процедуру с сывороткой бычьей лейкоза, разбавленной в пропорции 1:5.

Когда агароза затвердеет, отверстия должны быть сделаны в ней следующим образом:

Чаша Петри N 1 Сыворотка 1:10 Чаша Петри N 2 Сыворотка 1:10

Чаша Петри N 3 Сыворотка 1:5 Чаша Петри N 4 Сыворотка 1:5

3. Добавление антигена:

(а) чаши Петри 1 и 3:

(i), лунка А - неразбавленный стандартизированный антиген;

(ii), лунка B - стандартизированный антиген в пропорции 1:2;

(iii) лунки C и E - стандартизированный антиген;

(iv), лунка D - неразбавленный тест-антиген;

(b) чаши Петри 2 и 4:

(i), лунка А - неразбавленный тест-антиген;

(ii), лунка B - тест-антиген в пропорции 1:2;

(iii) лунка C - тест-антиген в пропорции 1:4;

(iv), лунка D - тест-антиген в пропорции 1:8.

4. Дополнительные указания:

(а) эксперимент проводится с двумя растворами сыворотки (1:5 и 1:10), чтобы получить оптимальные осадки;

(b) если диаметр осадка слишком маленький в обоих растворах, то сыворотка должна быть еще разбавлена;

(с) если диаметр осадка слишком маленький в обоих растворах и он неявный, то должна быть выбрана более слабая сыворотка;

(d) конечная концентрация агарозы должна быть 0,8%, что соответствует 5 и 10% сыворотка