Глава II. Тестирование на определение энзоотического бычьего лейкоза

Глава II
Тестирование на определение энзоотического бычьего лейкоза

Тесты на определение энзоотического лейкоза крупного рогатого скота осуществляется при помощи теста иммунодиффузии в геле агара (AGID) в условиях, описанных в разделах А и B или иммуноферментного анализа (ELISA) при условиях, описанных в разделе С. Тест иммунодиффузии в геле агара может быть использован только для испытания отдельных образцов. Если результаты испытаний вызывают сомнения, дополнительная проверка осуществляется с помощью теста иммунодиффузии в геле агара.

AGID и ELISA должны быть стандартизированы по отношению к сыворотке E05, которая должна являться официальным стандартом сыворотки на территории Сообщества, поставляемые:

Институтом Фридриха Леффлера

Федеральный научно-исследовательский институт по охране здоровья животных

Справочная лаборатория OIE по энзоотическому лейкозу крупного рогатого скота (EBL)

Зюдуфер 10

17493 Грайфсвальд - остров Римс

Германия.

А. Тест иммунодиффузии в геле агара для определения энзоотического лейкоза крупного рогатого скота

1. Антиген, который будет использоваться в тесте должен содержать вирус бычьего лейкоза гликопротеин. Антиген должен быть стандартизирован относительно сыворотки E05.

2. Государственные институты, национальные исследовательские лаборатории или официальные институты, назначенные в соответствии со Статьей 6a, занимающиеся координацией стандартов и методов диагностики тестов для определения энзоотического лейкоза крупного рогатого скота, должны быть ответственными за стандартизацию рабочего антигена лаборатории относительно сыворотки E05.

3. Стандартные антигены, используемые в лаборатории, должны подтверждаться по крайней мере раз в год в государственных институтах, национальных исследовательских лабораториях или официальных институтах, назначенных в соответствии со Статьей 6a, на соответствие стандарту сыворотки E05. Помимо такой стандартизации антиген при использовании может быть скорректирован в соответствии с методом, описанным в Разделе B.

4. Реагенты испытаний должны состоять из:

(а) антигена: антиген должен содержать конкретный гликопротеин вируса энзоотического бычьего лейкоза, который стандартизирован в отношении сыворотки E05;

(b) тест-сыворотки;

(с) исследованной положительной контроль-сыворотки;

(d) геля агара:

- 0,8% агара,

- 8,5% NaCl,

- 0,05 М Трис-буфера, рН 7,2,

- 15 мл агара должны быть помещены в чашу Петри диаметром 85 мм, в результате чего слой агара должен стать 2,6 мм.

5. В тестовом образце агара нужно сделать семь сухих лунок до дна пластины; в образце должно быть одно центральное отверстие и шесть лунок вокруг него.

Диаметр центральной лунки: 4 мм

Диаметр внешних лунок: 6 мм

Расстояние между центральной и внешними лунками: 3 мм

6. Центральная лунка должна быть заполнена стандартным антигеном. Внешние лунки 1 и 4, описанные в B.3, заполняются известной положительной сывороткой; лунки 2, 3, 5 и 6 с тест-сывороткой. Лунки должны быть заполнены до исчезновения мениска. 

7. Необходимое количество веществ:

- Антиген: 32 мкл,

- Контроль-сыворотка: 73 мкл,

- тест-сыворотка: 73 мкл.

8. Инкубационный период - 72 часа при комнатной температуре (от 20 до 27°C) в закрытой влажной камере.

9. Результаты теста проявляются через 24 и 48 часов, но конечный результат будет только по истечении 72 часов:

(а) тест-сыворотка имеет положительный результат, если она образует линию преципитации с антигеном вируса бычьего лейкоза крупного рогатого скота (BLV) и полностью совпадает с контрольной сывороткой;

(b) тест-сыворотка является отрицательной, если она не образует осадков с антигеном BLV и если она не совпадает со шкалой контрольной сыворотки;

(c) реакция не может считаться удовлетворительной, если:

(i) показания шкалы тест-сыворотки совпадают с контрольной сывороткой относительно лунки с антигеном BLV без образования осадка с антигеном;

(ii), если результат не может быть определен как однозначно отрицательный или как однозначно положительный.

При отсутствии результатов реакции тест может быть повторен с использованием концентрированной сыворотки. 

10. Любая другая конфигурация лунок или же другой образец можно использовать с целью установления, что в сыворотке E05, разведенной в пропорции 1:10 в сыворотке с отрицательной реакцией, могут быть обнаружены положительные реакции.

B. Метод стандартизации антигена

1. Требуемые растворы и материалы:

(а) 40 мл 1,6% агарозы в 0,05 буфере М Tris/HCl , рН 7,2 с 8,5% NaCl;

(b) 15 мл сыворотки бычьего лейкоза, содержащей антитела вируса бычьего лейкоза - гликопротеины, разбавить в соотношении 1:10 в 0,05 буфере М Tris/HCl, рН 7,2 с 8,5% NaCl;

(с) 15 мл сыворотки бычьего лейкоза, содержащей антитела вируса бычьего лейкоза - гликопротеины, разбавить в соотношении 1:5 в 0,05 буфере М Tris/HCl, рН 7,2 с 8,5% NaCl;

(d) четыре пластиковые чаши Петри диаметром 85 мм;

(е) чаша диаметром от 4 до 6 мм;

(f) стандартизированный антиген;

(g) антиген, который должен быть стандартизирован;

(h) водяная баня (56 ° C).

2. Процедура:

Растворите агарозу (1,6%) в буфере Tris/HCl, аккуратно нагрейте до 100°C. Поставьте на водяную баню 56°С примерно на 1 час. Кроме того, разместите растворы сыворотки лейкоза крупного рогатого скота на водяную баню такой же температуры.

Теперь смешайте 15 мл 56°C раствора агарозы и 15 мл сыворотки бычьего лейкоза (1:10), быстро встряхните и налейте по 15 мл в каждую из двух чаш Петри. Повторите эту процедуру с сывороткой бычьей лейкоза, разбавленной в пропорции 1:5.

Когда агароза затвердеет, отверстия должны быть сделаны в ней следующим образом:

Чаша Петри N 1 Сыворотка 1:10 Чаша Петри N 2 Сыворотка 1:10

Чаша Петри N 3 Сыворотка 1:5 Чаша Петри N 4 Сыворотка 1:5

3. Добавление антигена:

(а) чаши Петри 1 и 3:

(i), лунка А - неразбавленный стандартизированный антиген;

(ii), лунка B - стандартизированный антиген в пропорции 1:2;

(iii) лунки C и E - стандартизированный антиген;

(iv), лунка D - неразбавленный тест-антиген;

(b) чаши Петри 2 и 4:

(i), лунка А - неразбавленный тест-антиген;

(ii), лунка B - тест-антиген в пропорции 1:2;

(iii) лунка C - тест-антиген в пропорции 1:4;

(iv), лунка D - тест-антиген в пропорции 1:8.

4. Дополнительные указания:

(а) эксперимент проводится с двумя растворами сыворотки (1:5 и 1:10), чтобы получить оптимальные осадки;

(b) если диаметр осадка слишком маленький в обоих растворах, то сыворотка должна быть еще разбавлена;

(с) если диаметр осадка слишком маленький в обоих растворах и он неявный, то должна быть выбрана более слабая сыворотка;

(d) конечная концентрация агарозы должна быть 0,8%, что соответствует 5 и 10% сывороткам соответственно;

(е) диаметр измеряется в следующей системе координат. Исследуемый раствор антигена с таким же диаметром является рабочим раствором.

Диаметр в миллиметрах

Раствор антигена

C. Иммуноферментный анализ (ELISA) для определения энзоотического лейкоза крупного рогатого скота

1. Необходимые материалы и реактивы:

(а) планшеты с твердым покрытием, кюветы;

(b) антиген наносится на твердую поверхность с помощью или без помощи поликлональных или моноклональных захватывающих антител. Если антиген сразу покроет твердую поверхность, все образцы, давшие положительные реакции, нужно повторно сравнить с контрольным антигеном. Контрольный антиген должен соответствовать антигену, чтобы исключить отсутствие антигена BLV. Если захватывающие антитела покрыли твердую поверхность, антитела не должны реагировать с другими антигенами, кроме антигенов BLV;

(с) биологические жидкости для тестирования;

(d) соответствующие положительные и отрицательные контрольные образцы;

(e) конъюгат;

(f) подложки, адаптированные к используемым ферментам;

(g) раствор, останавливающий реакцию, если это необходимо;

(h) растворы для разведения тестируемых образцов для подготовки реагентов и для промывки;

(i) системы считывания соответствующей используемой подложки.

2. Стандартизация и чувствительность теста

Чувствительность ELISA должна быть такого уровня, чтобы сыворотка E05 показывала положительный результат при разбавлении в 10 раз (образцами сыворотки) или в 250 раз (пробами молока) больше, чем полученные растворы отдельных образцов, когда они включены в группы. При исследованиях, где образцы (сыворотки и молока) проверяется индивидуально, сыворотка E05, разведенная 1 к 10 (в отрицательной сыворотке) или от 1 к 250 (в отрицательном молоке) должна показать положительный результат при том же образце раствора, как для отдельных образцов. Институты, указанные в пункте 2 Раздела А, должны нести ответственность за проверку качества ELISA, в частности, за определение для каждой партии продукции количества образцов для обследования относительно сыворотки Е05.

3. Условия использования ELISA для определения энзоотического лейкоза крупного рогатого скота

(a) ELISA может быть использована для исследования сыворотки и образцов молока.

(b) ELISA может использоваться для целей сертификации в соответствии со Статьей 6 (2) (с) или для установления и поддержания статуса стада в соответствии с приложением D (I), объединения образцов сыворотки или их разделения таким образом, чтобы образцы, взятые для экспертизы, могли быть соотнесены с отдельными животными группы. Любой подтверждающий тест осуществляется на основании образцов, взятых у отдельных животных.

(c) Если ELISA проводится на образцах смеси молока, этот образец должен состоять из молока, взятого по меньшей мере у 30% дойных коров стада. Любой подтверждающий тест осуществляется на основании образцов, взятых у отдельных животных.