Приложение В. Туберкулез

Приложение В*(80)

Туберкулез

1. Идентификация возбудителя

Наличие Mycobacterium Bovis (M. Bovis), возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота, в медицинских и патологоанатомических образцах может быть выявлено путем исследования окрашенных мазков или при помощи иммунопероксидазных методов. Наличие такого возбудителя подтверждается наличием культуры при методе первичного посева.

Патологический материал для подтверждения M. Bovis должен браться из аномальных лимфатических узлов и паренхиматозных органов, таких как легкие, печень, селезенка, и т.д. В тех случаях, когда животное не обладает такими патологическими изменениями, образцы для исследования должны браться из заглоточной области, бронхов, средостения, надвыменной части, нижней челюсти и из некоторых брыжеечных лимфатических узлов и печени.

Идентификация изолированных животных может проводиться путем определения культурных и биохимических свойств. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) также может быть использована для выявления комплекса микобактерий туберкулеза. Методы анализа ДНК могут оказаться более быстрым и надежными, чем биохимические методы дифференциации М. Bovis от других составляющих комплекса микобактерий туберкулеза. Генетические отличительные признаки позволяют разграничить различные штаммы M. Bovis и позволяют описать причины происхождения, передачи и распространения M. Bovis. Используемые методы и техники, их стандартизация и интерпретация результатов должны соответствовать указанным в Руководстве OIE по диагностическим тестам и вакцинам, четвертое издание, 2000 г., Глава 2.3.3 (туберкулез крупного рогатого скота).

2. Кожная проба на туберкулин

Туберкулин PPD (производный очищенный белок), который отвечает стандартам изложенными в параграфе 2.1, должен использоваться для проведения официальных туберкулиновых проб в соответствии с процедурами, указанными в параграфе 2.2.

2.1. Стандарты для туберкулина (для крупного рогатого скота и птиц)

2.1.1. Определение

Очищенный белковый дериват туберкулина (PPD туберкулин, бычий или птичий) представляет собой препарат, полученный из термически обработанных продуктов развития и лизиса Micobacterium bovis или Micobacterium avium (в зависимости от обстоятельств), способных проявлять повышенную чувствительность в организме животных на микроорганизмы такого же вида.

2.1.2. Производство

Туберкулин производится из водорастворимых фракций, полученных путем нагревания паром, а затем фильтрации культур M. Bovis или avium, выращенных в жидкой синтетической среде. Активные фракции фильтрата, содержащие в основном белок, выявляются при выпадении осадка, который в дальнейшем промывается и снова растворяется. Может быть добавлен противомикробный консервант, который не позволяет проявиться ложноположительной реакции, например, фенол. Окончательные стерильные приготовления без микобактерий проводятся в обеззараженном стерильном стеклянном контейнере, который затем закрывается, чтобы избежать заражения. Производство может быть лиофилизировано. 

2.1.3. Идентификация продукта

Введите внутрикожно последовательно возрастающие дозы в различные соответствующие чувствительные участки тела белых морских свинок, каждая весом не менее 250 г. В течение 24 - 28 часов проявляется реакция в виде отеков с эритемой или без некроза в точках инъекций. Размер и серьезность реакции варьируются в зависимости от дозы. Несенсибилизированные морские свинки не проявляют реакции на подобные инъекции.

2.1.4. Испытания

2.1.4.1. рН: рН от 6,5 до 7,5.

2.1.4.2. Фенол: если исследуемый препарат содержит фенол, его концентрация должна быть не более 5 г/л.

2.1.4.3. Сенсибилизирующее действие: используйте группу из трех морских свинок, которые не подвергались действию материалов, способных помешать тестированию. Три раза с интервалом в пять дней вводят внутрикожно в каждую морскую свинку дозу исследуемого препарата, эквивалентную 500 МЕ на 0,1 мл. Через 15 - 21 дней после третьей инъекции животные получают такую же дозу (500 МЕ) внутрикожно, а также три морские свинки контрольной группы такой же массы, которые до этого не получали инъекций туберкулина. Через 24 - 28 часов после последней инъекции реакции этих двух групп не будут существенно отличаться.

2.1.4.4. Токсичность: используйте двух морских свинок, каждая весом не менее 250 г и которые не подвергались действию материалов, способных помешать тестированию. В каждую морскую свинку вводят инъекцию подкожно 0,5 мл препарата, который исследуется. Наблюдать за животными необходимо в течение семи дней. В течение периода наблюдения никакие аномальные явления не проявляются.

2.1.4.5. Стерильность: тест на стерильность, предписанный Монографией по вакцинам для ветеринарного применения 4-е издание 2002 г. Европейской Фармакопеи.

2.1.5. Эффективность

Эффективность очищенного производного белка туберкулина (для крупного рогатого скота и птиц) определяется путем сравнения реакций, происходящих в организмах сенсибилизированных морских свинок при внутрикожных инъекциях разбавленного препарата, произведенного в известной пропорции относительно эталонного препарата туберкулина (бычьего или птичьего), очищенного белковым дериватом, калиброванным в международных единицах.

Чтобы проверить эффективность, необходимо исследовать не менее девяти белых морских свинок, каждая весом от 400 г до 600 г, делая при этом глубокие внутримышечные инъекции по 0,0001 мг влажной массы живых M. Bovis штамма AN5, выпавшего в осадок в количестве 0,5 мл на 9 г/л раствора натрия хлорида R для бычьего туберкулина, или подходящей дозы инактивированной или живой M. avium птичьего туберкулина. Не менее чем через четыре недели после сенсибилизации морских свинок, им бреют бока, чтобы обеспечить пространство для не более чем четырех инъекций с каждой стороны. Подготовьте разведенный исследуемый препарат, и эталонный препарат, в котором используется изотонический фосфатно-буферный физиологический раствор (рН 6,5 - 7,5), содержащий 0,005 г/л полисорбата 80 R. Используйте не более трех доз контрольного препарата и не менее трех доз исследуемого препарата. Выбирайте такие дозы, чтобы диаметр поражения был не менее 8 мм и не более 25 мм. Распределите растворы в случайном порядке по участкам с помощью латинских решеток-квадратов. Вводите каждую дозу внутрикожно фиксированным объемом 0,1 мл или 0,2 мл. Измерьте диаметры поражения через 24 - 28 часов и вычислите результат теста с использованием обычных статистических методов при условии, что диаметр поражения прямо пропорционален логарифму концентрации туберкулина.

Тест не является действительным, если пределы погрешности (P = 0,95) лежат в диапазоне не менее 50% и не более 200% от предполагаемой эффективности.

Расчетная эффективность составляет не менее 66% и не более чем 150% заявленной эффективности туберкулина для крупного рогатого скота. Предполагаемая эффективность - не менее 75% и не более 133% от указанной эффективности для птичьего туберкулина. Заявленная эффективность - не менее 20 000 МЕ/мл для туберкулина (крупного рогатого скота и птиц).

2.1.6. Хранение

Хранить в защищенном от света месте, при температуре °С.

2.1.7. Маркировка

Информация на этикетке:

- эффективность в международных единицах на миллилитр;

- наименование и количество любого добавленного вещества;

- для лиофилизированных препаратов:

- наименование и объем восстанавливающей жидкости, которую следует добавить;

- информация о том, что продукт должен быть использован сразу же после разведения.

2.2. Процедуры испытаний

2.2.1. Следующие действия являются алгоритмом проведения официальных внутрикожных туберкулиновых тестов:

- единичный внутрикожный тест: необходима однократная инъекция бычьего туберкулина,

- внутрикожный сравнительный тест: необходима одна инъекция бычьего туберкулина и одна инъекция птичьего туберкулина одновременно.

2.2.2. Доза введенного туберкулина должны быть:

- не менее 2 000 МЕ бычьего туберкулина,

- не менее 2 000 МЕ птичьего туберкулина.

2.2.3. Объем каждой дозы инъекции не должен превышать 0,2 мл.

2.2.4. Туберкулиновые пробы осуществляется путем введения туберкулина в кожу шеи. Места инъекций должны быть расположены на границе передней и средней трети шеи. Когда оба вида туберкулина вводят в одних и тех же животных, площадка для введения птичьего туберкулина должна быть около 10 см от гребня шеи, а место для инъекции бычьего туберкулина на 12,5 см ниже на линии, параллельной с линией плеча или на разных сторонах шеи; у молодых животных, у которых недостаточно места для разделения участков на одной стороне шеи, инъекции нужно сделать на каждой стороне шеи на одинаковых площадях в центр средней трети шеи.

2.2.5. Методика тестирования туберкулина и интерпретация реакции должны быть следующими:

2.2.5.1. Техника:

Места инъекций должны быть зафиксированы и очищены. Складку кожи выбранных областей нужно зажать между указательным и большим пальцами и измерить прибором, результат записать. Доза туберкулина вводится таким образом, чтобы обеспечить его мгновенное всасывание. Короткая стерильная игла коническими краями наружу с необходимым объемом туберкулина вставляется наклонно в глубокие слои кожи. При правильном введении инъекции под кожей можно прощупать уплотнение размером с небольшую горошину и припухлость в месте инъекции. Толщину кожи каждого места инъекции необходимо измерить через 72 часа ( часа) после инъекции и записать.

2.2.5.2. Интерпретация результатов

Интерпретация реакций должна быть основана на клинических наблюдениях и записях увеличения толщины кожи на участках инъекций через 72 часа после введения туберкулина.

(а) Отрицательная реакция: наблюдается небольшой отек, толщина кожи увеличивается не более чем на 2 мм без клинических признаков, таких как диффузный или обширный отеки, экссудация, некроз, боль или воспаление лимфатических протоков на этом участке или в лимфатических узлах.

(b) Неопределенная реакция: при отсутствии клинических признаков, упомянутых в пункте (а), наблюдается увеличение толщины кожного покрова от 2 до 4 мм.

(с) Положительная реакция: наблюдаются клинические признаки, такие, как указано в пункте (а), или есть увеличение толщины кожных складок на 4 мм и более в месте инъекции.

2.2.5.3. Алгоритм официальной интерпретации внутрикожных туберкулиновых тестов:

2.2.5.3.1. Единичный внутрикожный тест:

(а) положительно: положительная реакция крупного рогатого скота определена в пункте 2.2.5.2 (с);

(b) неопределенный результат: неубедительная реакция определена в пункте 2.2.5.2 (b);

(c) отрицательно: отрицательная реакция крупного рогатого скота определена в пункте 2.2.5.2 (а).

Животные, результаты тестов которых неопределенны, должны пройти другое обследование как минимум через 42 дня. 

Если реакция на тест не является отрицательной в этом втором тесте, то считается, что животное показало положительную реакцию.

Животные, показавшие положительную реакцию при тестировании в одном из внутрикожных тестов, могут быть подвергнуты внутрикожному сравнительному тесту, чтобы исключить ложные положительные реакции или помехи. 

2.2.5.3.2. Сравнительные интрадермальные испытания для установления и поддержания статуса стада как официально не зараженного туберкулезом:

(а) положительно: положительная реакция на бычий туберкулин - уплотнение более 4 мм, чем на птичий туберкулин, или при наличии клинических признаков;

(b) отсутствие реакции: положительная или неясная реакции на бычий туберкулин выражается в следующих параметрах - увеличение от 1 до 4 мм больше, чем реакция на птичий туберкулин при отсутствии клинических признаков;

(с) отрицательно: отрицательная реакция на бычий туберкулин или положительная, или неясная, но которая равна или меньше результата положительной или безрезультатной реакции на птичий туберкулин при отсутствии клинических признаков в обоих случаях.

Животные, реакция которых оказалась неясной, должны пройти еще один тест через как минимум 42 дня. Животные, не показавшие отрицательную реакцию в этом втором тесте, считаются получившими положительный результат. 

2.2.5.3.3. Статус стада, официально не зараженного туберкулезом, может быть приостановлен. В таком случае животные этого стада не допускаются на внутренний рынок Европейского Сообщества до тех пор, пока судьба следующих животных не будет решена:

(а) животных, которые получили неопределенный результат в единичном тесте;

(b) животных, которые не получили положительной реакции на туберкулин, но ожидают повторных внутрикожных сравнительных тестов;

(с) животных, которые получили неясный результат во внутрикожном сравнительном тесте.

2.2.5.3.4. В случае если законодательство Европейского Сообщества требует, чтобы животные проходили интрадермальные тесты до отправки в другое место, то результаты тестов должны быть интерпретированы таким образом, чтобы животные, у которых наблюдается утолщение кожного покрова больше, чем на 2 мм или появляются клинические признаки, не были допущены на внутренний рынок Европейского Сообщества. 

2.2.5.3.5. Чтобы обнаружить максимальное число инфицированных и больных животных в стаде или в регионе, государства-члены ЕС могут изменить критерии интерпретации результатов теста в целях увеличения сенситивности теста с учетом всех безрезультатных реакций, упомянутых в пунктах 2.2.5.3.1 (b) и 2.2.5.3.2 (b) в качестве положительных реакций.

3. Дополнительные испытания

Чтобы увеличить число выявленных инфицированных и больных животных в стаде или в регионе, государства-члены ЕС могут разрешить использовать гамма-интерферонные исследования, указанные в Руководстве OIE по диагностическому тестированию и вакцинации, 4-е издание, 2000 г., Глава 2.3.3. (Туберкулез крупного рогатого скота), в дополнение к туберкулиновой пробе.

4. государственные институты и национальные исследовательские лаборатории

4.1. Задачи и ответственность

Государственные институты, национальные исследовательские лаборатории или официальные институты, назначенные в соответствии со Статьей 6, несут ответственность за официальные испытания туберкулина или реагентов, упомянутых в параграфах 2 и 3 на территории государств-членов ЕС, где они находятся. Данные испытания проводятся с целью стандартизации и соответствия туберкулина и реагентов по отношению к стандартам, указанным в пункте 2.1 и параграфе 3 соответственно.