Методические указания МУК 4.2.1067-01 "Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 - продуцента монензина в воздухе рабочей зоны" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20 сентября 2001 г.)

Методические указания
МУК 4.2.1067-01
"Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 - продуцента монензина в воздухе рабочей зоны"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20 сентября 2001 г.)

Дата введения: с момента утверждения

Введен впервые

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 - продуцента монензина в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Характеристика штамма-продуцента монензина

Микроорганизм Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 является продуцентом антибиотика монензина. Штамм растет на различных агаризованных и жидких средах. Культура образует цепочки спор, обычно прямые или слегка извилистые, с гладкой оболочкой. На твердой питательной среде ISP на 3 сутки роста при температуре 28°С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с кремовым или сероватым налетом, фестончатым краем и выпуклым более темным центром, диаметром 1-2 мм. На шестые сутки инкубации размеры колонии достигают 3-5 мм, конфигурация и складчатость колоний не изменяется, образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, в среду выделяет коричневый пигмент. Штамм устойчив к следующим антибиотикам: левомицетину (30 мкг/мл), линкомицину (15 мкг/мл), полимиксину М (100 мкг/мл), эритромицину (мкг/мл), тетрациклину (30 мкг/мл) и олеандомицину (15 мкг/мл). 3000 .

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента монензина в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента монензина на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)	ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический	ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211
Луна с увеличением х 10	ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл	ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл	ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл	ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл	ГОСТ 1770-74
Секундомер	ГОСТ 9586-75
Барометр	ГОСТ 24696-79
Марля медицинская	ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая	ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Антибиотики: левомицетин, линкомицин, полимиксин М, эритромицин, тетрациклин, олеандомицин и нистатин
Спирт этиловый ректификат	ГОСТ 5962-67
Селективная среда для штамма-продуцента Среда ISP: Мальт-экстракт (Difco) - 1,5%, дрожжевой экстракт (Difco) - 0,5%, крахмал растворимый - 0,5%, мел химический осажденный - 0,3%, Бакто-агар (Difco) - 2,0%, вода дистиллированная - 100 мл, рН 7,2 - 7,4.

6.Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента монензина в воздухе рабочей зоны соблюдают:

- правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;

- правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;

- положения "Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (205)°С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерений

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения продуцента монензина воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний выросших на 3 - 6-е сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60°С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного из антибиотиков (левомицитин, линкомицин, цефалотин или другой, указанные в разделе 2) для подавления посторонней бактериальной микрофлоры и нистатина (10 мкг/мл) для подавления грибковой флоры, тщательно перемешивают и разливают по 10 - 15 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37°С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при 28°С. Через 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерений

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 воздуха производят по формуле:

, где

Х - концентрация(клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При этом пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 .

Составляем пропорцию:	на 100 за 1 мин оседает 2 л воздуха
	на 78,54	- Хл
	Х = 1,57 л/мин.

Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает количество бактерий, содержащееся в 1,57 л воздуха.

Надо определить количество клеток в 1 воздуха. На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащееся в 1,57 л воздуха, за Т мин - 1,57 .

В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 воздуха содержится

Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 воздуха содержится

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол N 

количественного микробиологического анализа штамма

Streptomyces cinnamonensis НИЦБ109 - продуцента монензина

в воздухе рабочей зоны

Дата проведения анализа _________________________

Место отбора пробы ______________________________

Название лаборатории ____________________________

Юридический адрес организации ___________________

Результаты микробиологического анализа

Шифр или N пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация,

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с).

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с).

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации - Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко