Методические указания МУК 4.2.1068-01 "Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента тилозина Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20 сентября 2001 г.)

Методические указания
МУК 4.2.1068-01
"Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента тилозина Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20 сентября 2001 г.)

Дата введения: с момента утверждения

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма-продуцента тилозина Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе производственных помещений биотехнологических производств и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий научно-исследовательских институтов, работающих в области промышленной гигиены.

2. Биологическая характеристика штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1 и его гигиенический норматив

Систематическое положение штамма-продуцента

Порядок	Actinomycetales
Класс	Actinomycetes
Семейство	Streptomycetaceae
Род	Streptomyces
Вид	fradiae
Штамм	БС-1

Культурально-морфологические особенности штамма

Штамм Streptomyces fradiae БС-1 является облигатным аэробом, растет на различных питательных средах: СР-6, СР-15, Гаузе-1, Ваксмана путем инкубирования в термостате при температуре 28°С. Продолжительность развития составляет 10-15 суток.

Четкие культурально-морфологические свойства штамма проявляются на агаризованной среде СР-15 на 3 день развития. На этой среде штамм образует 6 морфологических типов колоний, из которых наиболее характерный тип составляет более 70%. Изучаемый штамм представлен округлыми колониями до 9 мм в диаметре (в зависимости от плотности посева). Белый воздушный мицелий образуется в центре колонии и по периферии в виде одной, реже двух концентрических окружностей, край колоний не опушен. Профиль изогнутый, поверхность шероховатая, неопушенные части колоний гладкие, блестящие, кремовые. Структура мелкозернистая, по краю неопушенной части однородная. Консистенция плотная, пигмент с обратной стороны колоний желтовато-коричневый.

Предельно допустимая концентрация Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны - 2000 , пометка А, 3 класс опасности.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента тилозина в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод измерения концентрации штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1 основан на аспирации аппаратом Кротова микробных клеток (спор, обрывков мицелия) на поверхность плотной питательной среды СР-15 и подсчета выросших колоний, которые выявляются при задержке роста тест-культуры (Bacillus subtilis), происходящего вследствие диффузии в агар антибиотика, выделяемого штаммом-продуцентом Streptomyces fradiae БС-1.

При данном методе на чашке Петри после забора пробы может быть учтено до 50 колоний, т. к. большее количество колоний на чашке могут образовывать сливающиеся зоны лизиса, что приводит к занижению результатов.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)	ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический	ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211
Водяная баня или водяной термостат
Газовая горелка или спиртовка лабораторная
Чашки Петри
Петли бактериологические
Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл	ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл	ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5, и 10 мл	ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл	ГОСТ 1770-74
Секундомер	ГОСТ 9586-75
Барометр	ГОСТ 24696-79
Марля медицинская	ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая	ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Среда СР-15, агаризованная питательная среда для продуцента тилозина (состав в %: меласса - 0,5, крахмал - 0,5, соевая мука - 0,5, кукурузный экстракт - 0,5, - 0,1, NaCl - 0,1, - 0,05, - 0,2, агар - 1,5. рН среды до стерилизации 7,0 - 7,2. Режим стерилизации 1,1 - 1,2 атм., 40-50 мин) Агаризованная среда Хоттингера, рН 6,8 - 7,0
Спирт этиловый ректификат	ГОСТ 5962-67
Хлороформ
Тетрациклина гидрохлорид
Амфотерицин В для внутривенного введения Тест-культура Вас. subtilis вариант музейный штамм, споры хранят в виде водной суспензии при температуре 4°С.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента Биовита и хлортетрациклина в воздухе рабочей зоны соблюдают:

- правила техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88;

- правила электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации приборов;

- требования, изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980);

- положения "Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях в соответствии с ГОСТ 15150-69 при температуре воздуха ()°С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерений

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации Streptomyces fradiae БС-1 воздух производственных помещений аспирируют со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды СР-15 в чашку Петри, помещенную в аппарат Кротова.

Аппарат Кротова перед каждым отбором воздуха тщательно протирают спиртом. На подвижный диск устанавливают чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Крышку прибора закрывают. После отбора пробы воздуха и остановки диска открывают крышку прибора, снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. В период отбора проб воздуха крышку чашки Петри хранят в стерильном пакете из бумаги, полиэтилена или других стерильных емкостях.

Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны.

Отбор проб сопровождается составлением акта отбора с указанием места, времени и условий отбора.

9.2. Выполнение анализа

Агаризованную среду СР-15 расплавляют и остужают до 50 - 60°С. Затем добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде амфотерицин для инъекций из расчета 20 мкг на 1 л среды для подавления посторонней воздушной грибковой флоры, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри по 10 мл. Чашки с застывшей средой помещают в термостат при 37°С на сутки, после чего проросшие чашки бракуют.

После отбора проб воздуха на чашки Петри в аппарате Кротова их помещают в термостат при температуре 28-30°С на 48 ч.

После инкубации чашки помещают в вытяжной шкаф. На внутреннюю поверхность наливают 1,5 мл хлороформа, чашку с посевом вверх донышком вставляют в крышку так, чтобы выросшие колонии бактерий находились в парах хлороформа не менее 20 - 30 мин. Затем каждую чашку вынимают из крышки, выливают оставшийся хлороформ, снова закрывают крышками и переносят в бокс. Чашки оставляют в боксе на 2 ч при комнатной температуре для преддиффузии.

Затем чашки Петри заливают 5 мл агаризованной среды Хоттингера с тест-культурой Вас. subtilis вариант из расчета споровых клеток на 1 мл среды (Государственная фармакопея СССР, изд. XI, 1989, с. 206).

Чашки Петри с застывшей средой Хоттингера донышком вверх помещают в термостат при 37°С на сутки. По окончании инкубации, т. е. через 3 суток после отбора пробы воздуха производят подсчет зон задержки роста тест-культуры, которые соответствуют числу проросших клеток штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1. Учитывают зоны диаметром не менее 5 мм.

10. Вычисление результатов измерений

Расчет концентрации микробных клеток Streptomyces fradiae БС-1 в 1 воздуха производят по формуле:

, где

Х - количество микробных клеток в воздухе (1 );

П - число зон задержки роста тест-культуры, что соответствует числу колоний, выросших на чашке Петри;

Т - время забора пробы воздуха, мин;

В - скорость подачи воздуха, л/мин;

1000 - коэффициент перевода 1 л в 1 .

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол N 

количественного микробиологического анализа штамма-продуцента

Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны

Дата проведения анализа ___________________________

Место отбора пробы _______________________________

Название лаборатории ______________________________

Юридический адрес организации ______________________

Результаты микробиологического анализа

Шифр или N пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация,

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с).

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977,7 с).

5. Государственная фармакопея СССР, 1989, изд. XI, с. 206.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации - Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко