Методические указания МУК 4.1.1695-03 "Измерение массовых концентраций 2-(2,6-дихлорфениламино)имидазолина гидрохлорида (клофелин, клонидин) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ, Министерством здравоохранения РФ 29 июня 2003 г.)

Методические указания МУК 4.1.1695-03
"Измерение массовых концентраций 2-(2,6-дихлорфениламино)имидазолина гидрохлорида (клофелин, клонидин) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ, Министерством здравоохранения РФ 29 июня 2003 г.)

Дата введения: с момента утверждения

1. Область применения

Настоящие методические указания устанавливают количественный анализ воздуха рабочей зоны на содержание клофелина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в диапазоне массовых концентраций 0,0005-0,005 мг/м .

2. Характеристика вещества

2.1. Структурная формула

2.2. Эмпирическая формула .

2.3. Молекулярная масса 266,60.

2.4. Регистрационный номер CAS 4205-91-8.

2.5. Физико-химические свойства.

Клофелин - белый кристаллический порошок. Растворим в воде, этиловом и метиловом спиртах, плохо растворим в хлороформе и эфире.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.6. Токсикологическая характеристика.

Клофелин - производное имидазолина, гипотензивное средство центрального действия с седативным эффектом, оказывает остро направленное действие на ЦНС, обладает общетоксическим, кумулятивным и резко выраженным кожно-резорбтивным действием. Клофелин эффективен в чрезвычайно низких дозах (от 0,0375 мг). При работе с клофелином должен быть исключен его контакт с органами дыхания и кожей.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) клофелина в воздухе рабочей зоны 0,001 ; 1 класс опасности.

3. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций клофелина с погрешностью, не превышающей %, при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Измерения массовой концентрации клофелина выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением УФ-детектора.

Измерение проводят при длине волны 210 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения содержания клофелина в хроматографируемом объеме пробы (10 ) - 0,04 мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации клофелина в воздухе - 0,0005 (при отборе 8 000 воздуха).

Метод специфичен в условиях производства таблеток клофелина.

Определению не мешают крахмал картофельный, целлюлоза мелкокристаллическая, лактоза, магний стеариново-кислый.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и растворы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и растворы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Хроматограф жидкостный высокого давления "Милихром" или другие модели с УФ-детектором
Хроматографическая колонка размером 80х2 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом "СИЛАСОРБ SPH " с размером частиц 5 мкм
Весы лабораторные ВЛА-200	ГОСТ 24104-88Е
Аспирационное устройство, ПУ-3Э/220 с диапазоном расхода воздуха 40-400 ЗАО "Химко" "НОРД-ЭКОЛОГИЯ ХИМАВТОМАТИКА"	ТУ ЕВКН 4.471.000
Фильтродержатели	ТУ 95.72.05-77
Фильтры АФА-ВП-20	ТУ 95-743-80
Фильтры типа "Миллипор" или "Владипор", с диаметром пор 0,45 мкм	ТУ 6-05-221-433-79
Фильтры бумажные обеззоленные "белая лента", диаметр 5,5 см	ТУ 6-09-1678-77
Воронки химические, диаметр 30 мм	ГОСТ 25336-82Е
Колбы мерные, вместимостью 25, 50, 100	ГОСТ 1770-74Е
Колбы грушевидные, вместимостью 25	ГОСТ 25336-82Е
Пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10	ГОСТ 29227-91
Пробирки мерные с пришлифованными пробками, вместимостью 10	ГОСТ 25336-82Е
Бюксы химические с пришлифованными крышками, вместимостью 25	ГОСТ 25336-82Е
Баня ультразвуковая, фирмы "Шимадзу"
Секундомер	ГОСТ 5072-79
Лупа измерительная	ГОСТ 8309-75
Линейка измерительная металлическая	ГОСТ 427-75
Палочки стеклянные	ГОСТ 25336-82Е
Иономер универсального типа ЭВ-74 с погрешностью измерения не более 0,05 рН
Цилиндры мерные, вместимостью 10, 500, 1 000	ГОСТ 25336-82Е
Роторный испаритель, ИР-1М	ТУ 25-11-917-76
Дистиллятор	ТУ 61-1-7210-79

5.2. Реактивы, растворы

Клофелин, с содержанием основного вещества не менее 99,0%, в пересчете на сухое вещество	ФС 42-1776-91
Спирт этиловый, 95%, "ректификат"	ГОСТ 5963-67
Ацетонитрил, фирмы "Мерк" (ФРГ), для хроматографии
Аммоний уксусно-кислый, хч, 0,01 М раствор	ГОСТ 3117-78
Кислота ледяная уксусная, хч, плотность 1,05 ,0,01 М раствор	ГОСТ 61-75
Аммиак водный, 25%-й раствор	ТУ 2760-64
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72

Допускается применение иных средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими, метрологическими характеристиками и квалификацией не хуже приведенных в данном разделе.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа высокого давления соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие обучение и имеющие навыки работы на жидкостном хроматографе высокого давления.

8. Условия измерения

8.1. Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха ()°С, атмосферном давлении 84-106 кПа и относительной влажности воздуха не более 80%.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе высокого давления проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, элюента, подготовка жидкостного хроматографа высокого давления, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

9.1. Приготовление растворов

9.1.1. Основной стандартный раствор клофелина с концентрацией 500 готовят растворением 0,0500 г вещества в элюенте в мерной колбе вместимостью 100 . Раствор устойчив в течение 7 суток при хранении в холодильнике.

9.1.2. Стандартный раствор клофелина N 1 с концентрацией 100 готовят разбавлением 5 основного стандартного раствора элюентом в мерной колбе, вместимостью 25 . Раствор применяют свежеприготовленным.

9.1.3. Стандартный раствор клофелина N 2 с концентрацией 40 готовят разбавлением 10 стандартного раствора N 1 элюентом в мерной колбе вместимостью 25 . Раствор применяют свежеприготовленным.

9.1.4. 0,01 М водный раствор кислоты ледяной уксусной. В мерную колбу вместимостью 1 000 приливают 800 дистиллированной воды, добавляют 0,58 ледяной уксусной кислоты (плотность 1,05 ), доводят объем раствора дистиллированной водой до 1 000 и перемешивают. Раствор устойчив в течение 30 суток.

9.1.5. 0,01 М раствор аммония уксусно-кислого с рН 6,6. Растворяют 0,770 г аммония уксусно-кислого в 800 дистиллированной воды, доводят кислотой уксусной или аммиаком до рН , после чего доводят объем раствора водой до 1 000 и перемешивают. Раствор устойчив в течение 30 суток.

9.1.6. Элюент: непосредственно перед измерением в мерную колбу, вместимостью 500 , помещают 250 0,01 М раствора аммония уксусно-кислого с рН 6,600,02, прибавляют ацетонитрил до 500 и перемешивают. Затем раствор фильтруют с помощью фильтров типа "Миллипор" или "Владипор" и дегазируют пропусканием гелия в течение 15 мин.

9.2. Подготовка прибора

Подготовку жидкостного хроматографа высокого давления проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

9.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от массы клофелина в хроматографируемом объеме раствора пробы, устанавливают по методу абсолютной калибровки с использованием 6 серий градуировочных растворов из 5 параллельных определений для каждой серии, согласно табл. 1. Растворы применяют свежеприготовленными.

Таблица 1

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении клофелина

Номер стандарта	Стандартный раствор клофелина N 1,	Стандартный раствор клофелина N 2,	Элюент,	Массовая концентрация клофелина в градуировочном растворе,	Содержание клофелина в хроматографируемом объеме, мкг
1	0,00	0,0	10,0	0,00	0,00
2	0,00	1,0	9,00	4,0	0,04
3	1,00	0,0	9,00	10,0	0,10
4	1,50	0,0	8,50	15,0	0,15
5	2,00	0,0	8,00	20,0	0,20
6	3,00	0,0	7,00	30,0	0,30
7	4,00	0,0	6,00	40,0	0,40

Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб:

Температура термостата колонки 20°С.

Скорость подачи элюента 100 мкл/мин.

Чувствительность измерения детектора 0,1

Длина волны УФ-детектора 210 нм.

Скорость движения диаграммной ленты 3 мм/мин. Максимальный объем вводимой пробы 10 . Время удерживания клофелина 3 мин 9 с.

Эффективность колонки не менее 1 000 т.т.

Проверку градуировочного графика проводят не реже 1 раза в месяц или в случае использования новой партии реактивов или после ремонта прибора.

9.4. Отбор пробы воздуха

Воздух с объемным расходом 400 аспирируют через фильтр АФА-ВП-20, помещенный в фильтродержатель. Для измерения 1/2 ПДК клофелина следует отобрать 8 000 воздуха. Отобранные пробы могут храниться в течение трех суток в бюксах с пришлифованными крышками.

10. Выполнение измерения

Фильтр с отобранной пробой переносят в химический бюкс с пришлифованной крышкой, вместимостью 25 , приливают 5 95%-го этилового спирта и оставляют на 15 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтр отжимают и повторно обрабатывают 5 95%-го этилового спирта. Фильтр снова тщательно отжимают стеклянной палочкой и удаляют. Оба раствора последовательно фильтруют на химической воронке через бумажный фильтр "белая лента" в мерную пробирку, вместимостью 10 , и доводят 95%-м этиловым спиртом до метки. Полученный раствор сливают в грушевидную колбу, вместимостью 25 и упаривают под вакуумом при температуре 60-70°С досуха. Сухой остаток растворяют в 1 элюента и помещают в ультразвуковую баню на 10 мин. Степень десорбции вещества с фильтра 98%.

Хроматографирование анализируемых растворов проб проводят в тех же условиях, что и при построении градуировочной характеристики.

Количественное определение содержания клофелина (в мкг) в хроматографируемом объеме раствора пробы проводят по предварительно построенному градуировочному графику.

Примечание: фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в 95%-м этиловом спирте вспомогательных веществ, входящих в состав таблеток клофелина.

11. Вычисление результатов измерений

Массовую концентрацию клофелина (С, ) в воздухе вычисляют по формуле:

, где

а - содержание клофелина в хроматографируемом объеме раствора, найденное по градуировочному графику, мкг;

в - общий объем раствора пробы, ;

б - хроматографируемый объем пробы, ;

V - объем воздуха, отобранного для анализа () и приведенного к стандартным условиям (прилож. 1).

12. Оформление результатов анализа

Результат количественного анализа представляют в виде:

, , Р = 0,95

Значение = 0,000018 + 0,19С (), где

- характеристика погрешности.

13. Контроль погрешности методики КХА

Таблица 2

Значения характеристики погрешности, норматива оперативного контроля погрешности и норматива оперативного контроля воспроизводимости

Диапазон определяемых массовых концентраций клофелина,	Наименование метрологической характеристики
	характеристика погрешности, , , Р = 0,95	норматив оперативного контроля погрешности, К, , (Р = 0,90, m = 3)	норматив оперативного контроля воспроизводимости, D, , (Р = 0,95, m = 2)
0,0005-0,0050	0,000018 + 0,19С	0,000025 + 0,21С	0,000069 + 0,29С

Метрологические характеристики приведены в виде зависимости от значения массовой концентрации анализируемого компонента в пробе - С.

13.1. Оперативный контроль погрешности

Оперативный контроль погрешности выполняют в одной серии с КХА рабочих проб.

Образцами для контроля являются реальные пробы воздуха рабочей зоны. Объем отобранной для контроля пробы должен соответствовать удвоенному объему, необходимому для проведения анализа по методике. После отбора пробы экстракт с фильтра делят на две равные части, первую из которых анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы -. Вторую часть разбавляют соответствующим растворителем в два раза и снова делят на две равные части, первую из которых анализируют в точном соответствии с прописью методики, получая результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза - . Во вторую часть делают добавку анализируемого компонента (X) до массовой концентрации исходной рабочей пробы () (общая концентрация не должна превышать верхнюю границу диапазона измерения) и анализируют в точном соответствии с прописью методики, получая результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза, с добавкой - . Результаты анализа исходной рабочей пробы - , рабочей пробы, разбавленной в два раза - , и рабочей пробы, разбавленной в два раза с добавкой, - , получают по возможности в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении условия:

, где

- результат анализа рабочей пробы;

- результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза;

- результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза, с добавкой анализируемого компонента;

Х - величина добавки анализируемого компонента;

К - норматив оперативного контроля погрешности.

К = 0,000025 + 0,21 С, ()

13.2. Оперативный контроль воспроизводимости

Образцами для контроля являются реальные пробы воздуха рабочей зоны.

Объем отобранной для контроля пробы должен соответствовать удвоенному объему, необходимому для проведения анализа по методике. После отбора пробы экстракт с фильтра делят на две равные части и анализируют в точном соответствии с прописью методики, максимально варьируя условия проведения анализа, т.е. получают два результата анализа в разных лабораториях или в одной, используя при этом разные наборы мерной посуды, разные партии реактивов. Два результата анализа не должны отличаться друг от друга на величину допускаемых расхождений между результатами анализа:

, где

- результат анализа рабочей пробы;

- результат анализа этой же пробы, полученный в другой лаборатории или в этой же, но другим аналитиком с использованием другого набора мерной посуды и других партий реактивов;

D - допустимые расхождения между результатами анализа одной и той же пробы.

D = 0,000069+ 0,29С, ()

При превышении норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива D выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

14. Нормы затрат времени на анализ

Для проведения серии анализов из 6 проб требуется 5 ч.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко