Приложение 3. Сбор проб воды с помощью пакетов с макропористым стеклом и последующая обработка

Приложение 3

Сбор проб воды с помощью пакетов с макропористым стеклом и последующая обработка

Метод используют для концентрирования вирусов из сточной воды, воды поверхностных водоёмов. Метод может быть использован для концентрирования вирусов из питьевой воды при небольшой модификации способа сбора: пакет с сорбентом помещают в ёмкость, через которую медленно протекает исследуемая вода, и оставляют на 1-3 суток, так, чтобы пакет всё время находился погружённым в воду.

1. Сбор проб.

1. 1. Подготовка МПС.

Для повышения сорбционных свойств МПС его обрабатывают следующим образом:

- готовят смесь из 1 части 3% раствора и 1 части 6 М раствора HCl;

- добавляют 1 объём МПС к 1 объёму этой смеси и кипятят в открытом сосуде в вытяжном шкафу в течение 1 часа;

- промывают МПС дистиллированной водой до нейтрального рН и высушивают при 100°С;

- в пакет из водопроницаемого материала (флизилина) размером 5 х 7 см помещают 3 подготовленного МПС.

1.2. Отбор проб.

Пакет с сорбентом с помощью прочной лески закрепляют в токе воды. После экспозиции в течение 3-7 суток пакет вынимают, помещают в полиэтиленовый мешок или стерильный флакон, помещают в термоконтейнер, обеспечивающий поддержание температурного режима +4 - +8°С, доставляют в лабораторию в максимально короткий срок. Пробу маркируют, указывая на упаковочном пакете точку отбора, время экспозиции пакета. До обработки пробу можно хранить не более суток при +4°С.

2. Обработка проб.

2.1. Предварительная подготовка стеклянных колонок.

Для предотвращения нежелательной адсорбции вирусов на стенках колонки смачивают их внутреннюю поверхность раствором силикона, сливают эту жидкость и выдерживают колонки 1 час при 100°С. Слитую силиконовую жидкость можно использовать повторно.

2.2. Обработка проб.

Пакет с сорбентом извлекают из упаковочного полиэтиленового мешка и помещают в стерильную чашку Петри. Обрезают верхний край пакета, сорбент вымывают при помощи стерильной пипетки стерильной дистиллированной водой (примерно 5,0 мл) и с помощью пипетки (или через воронку) переносят в колонку объёмом 5-10 мл. Вирусы элюируют последовательно тремя порциями стерильных растворов по 3,0 мл каждый:

1) 0,05 М Трис-HCl pH 9,1

2) 0,05 М Трис-HCl pH 9,1c 0,5 M NaCl

3) 3% говяжий экстракт на 0,05 М Трис-HCl pH 9,1.

Каждую из 3-х фракций (элюатов) собирают и исследуют отдельно. До исследования фракции обрабатывают хлороформом. Для этого добавляют 1/2 объёма хлороформа на один объём элюата, тщательно встряхивают 10 минут и центрифугируют при 1500g 10 минут, чтобы разделить фазы. Водную верхнюю фазу переносят пипеткой в стерильный флакон, добавляют пенициллин и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл и 100 мг/мл, соответственно.

2.3. Приготовление растворов для элюции вирусов с МПС.

Готовят 10-кратные концентраты элюирующих растворов на дистиллированной воде.

Раствор 1.

Растворяют 30,3 г триса (трис гидроксиметил аминометан) в 300-400 мл воды, доводят значение рН до 9,1 концентрированной HCl и оставляют на сутки. Проверяют значение рН, при необходимости доводят ещё раз. Добавляют дистиллированную воду до конечного объёма раствора 500 мл.

Раствор 2.

Растворяют 30,3 г триса + 145 г NaCl в 300-400 мл воды, доводят значение рН до 9,1 концентрированной HCl и оставляют на сутки. Проверяют значение рН, при необходимости доводят ещё раз. Добавляют дистиллированную воду до конечного объёма раствора 500 мл.

Раствор 3.

150 г мясного экстракта + 350 мл трис-HCl рН 9,1.

Растворы автоклавируют 15 минут при 1 атмосфере.

Рабочие разведения получают добавлением 9 частей стерильной дистиллированной воды к 1 части концентрированного раствора.