Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Приложение 3
Сбор проб воды с помощью пакетов с макропористым стеклом и последующая обработка
Метод используют для концентрирования вирусов из сточной воды, воды поверхностных водоёмов. Метод может быть использован для концентрирования вирусов из питьевой воды при небольшой модификации способа сбора: пакет с сорбентом помещают в ёмкость, через которую медленно протекает исследуемая вода, и оставляют на 1-3 суток, так, чтобы пакет всё время находился погружённым в воду.
1. Сбор проб.
1. 1. Подготовка МПС.
Для повышения сорбционных свойств МПС его обрабатывают следующим образом:
- готовят смесь из 1 части 3% раствора и 1 части 6 М раствора HCl;
- добавляют 1 объём МПС к 1 объёму этой смеси и кипятят в открытом сосуде в вытяжном шкафу в течение 1 часа;
- промывают МПС дистиллированной водой до нейтрального рН и высушивают при 100°С;
- в пакет из водопроницаемого материала (флизилина) размером 5 х 7 см помещают 3 подготовленного МПС.
1.2. Отбор проб.
Пакет с сорбентом с помощью прочной лески закрепляют в токе воды. После экспозиции в течение 3-7 суток пакет вынимают, помещают в полиэтиленовый мешок или стерильный флакон, помещают в термоконтейнер, обеспечивающий поддержание температурного режима +4 - +8°С, доставляют в лабораторию в максимально короткий срок. Пробу маркируют, указывая на упаковочном пакете точку отбора, время экспозиции пакета. До обработки пробу можно хранить не более суток при +4°С.
2. Обработка проб.
2.1. Предварительная подготовка стеклянных колонок.
Для предотвращения нежелательной адсорбции вирусов на стенках колонки смачивают их внутреннюю поверхность раствором силикона, сливают эту жидкость и выдерживают колонки 1 час при 100°С. Слитую силиконовую жидкость можно использовать повторно.
2.2. Обработка проб.
Пакет с сорбентом извлекают из упаковочного полиэтиленового мешка и помещают в стерильную чашку Петри. Обрезают верхний край пакета, сорбент вымывают при помощи стерильной пипетки стерильной дистиллированной водой (примерно 5,0 мл) и с помощью пипетки (или через воронку) переносят в колонку объёмом 5-10 мл. Вирусы элюируют последовательно тремя порциями стерильных растворов по 3,0 мл каждый:
1) 0,05 М Трис-HCl pH 9,1
2) 0,05 М Трис-HCl pH 9,1c 0,5 M NaCl
3) 3% говяжий экстракт на 0,05 М Трис-HCl pH 9,1.
Каждую из 3-х фракций (элюатов) собирают и исследуют отдельно. До исследования фракции обрабатывают хлороформом. Для этого добавляют 1/2 объёма хлороформа на один объём элюата, тщательно встряхивают 10 минут и центрифугируют при 1500g 10 минут, чтобы разделить фазы. Водную верхнюю фазу переносят пипеткой в стерильный флакон, добавляют пенициллин и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл и 100 мг/мл, соответственно.
2.3. Приготовление растворов для элюции вирусов с МПС.
Готовят 10-кратные концентраты элюирующих растворов на дистиллированной воде.
Раствор 1.
Растворяют 30,3 г триса (трис гидроксиметил аминометан) в 300-400 мл воды, доводят значение рН до 9,1 концентрированной HCl и оставляют на сутки. Проверяют значение рН, при необходимости доводят ещё раз. Добавляют дистиллированную воду до конечного объёма раствора 500 мл.
Раствор 2.
Растворяют 30,3 г триса + 145 г NaCl в 300-400 мл воды, доводят значение рН до 9,1 концентрированной HCl и оставляют на сутки. Проверяют значение рН, при необходимости доводят ещё раз. Добавляют дистиллированную воду до конечного объёма раствора 500 мл.
Раствор 3.
150 г мясного экстракта + 350 мл трис-HCl рН 9,1.
Растворы автоклавируют 15 минут при 1 атмосфере.
Рабочие разведения получают добавлением 9 частей стерильной дистиллированной воды к 1 части концентрированного раствора.
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.