Приложение 2. Концентрирование проб сточных вод методом двухфазного разделения

Приложение 2

Концентрирование проб сточных вод методом двухфазного разделения

1. Подготовка реактивов (для двух проб по 1,0 л)

1.1. 22% декстран (по весу) - 40 г декстрана Т40, 142 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при + 4°С.

1.2. 29% ПЭГ 6000 (по весу) - 363 г ПЭГ 6000 и 888 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при + 4°С. Раствор можно автоклавировать (15 мин. при 450С).

1.3. 150 мл (примерно) 5М NaCl.

1.4. 1N NaOH и 1N HCl для установки рН.

2. Концентрирование пробы (0,5 л).

2.1. Жидкость пробы центрифугируют в течение 10 минут при 1000 g (если это необходимо, пробу делят на несколько порций), надосадочную жидкость переносят из пробирок в колбу Эрленмейера ёмкостью 1,0 л. Осадок хранят при + 4°С.

2.2. Доводят рН надосадочной жидкости до нейтрального уровня (7,0-7,5). Обычно для этого требуется несколько мл 1N раствора NaOH. Измеряют конечный объём надосадочной жидкости.

2.3. К 500 мл надосадочной жидкости добавляют 39,5 мл 22% раствора декстрана, 287 мл 29% раствора ПЭГ 6000 и 35 мл 5 N раствора NaCl. Тщательно перемешивают и выдерживают 1 час при температуре + 4°С. используя прибор горизонтального встряхивания или магнитную мешалку.

2.4. Для каждой пробы подготавливают стерильную коническую делительную воронку и закрепляют её в штативе. Смазывают скользящие поверхности кранов, но так, чтобы не закрыть в них отверстие, проверяют плотность кранов небольшим количеством воды. Смесь, приготовленную как указано в п.2.3., переливают в воронку и оставляют на ночь при + 4°С.

2.5. На следующее утро осторожно открывают кран воронки, медленно выпускают жидкость и собирают в стерильную пробирку её нижний слой и промежуточную фазу (обычно 5-10 мл от каждой пробы объёмом 0,5 л).

2.6. К жидкости, собранной в пробирке (п.2.5.) добавляют осадок (п.2.1.), хлороформ (20% от объёма образовавшейся взвеси), встряхивают в течение 1 мин. Центрифугируют (20 минут при 1500g), отбирают водную фазу в стерильную пробирку и добавляют антибиотики (пенициллин и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл и 100 мг/мл, соответственно).

2.7. Одну часть полученного концентрата (1 мл) хранят при температуре минус 20°С (или минус 70°С, если есть возможность) для повторного исследования, если возникнет такая необходимость. Вторую часть концентрата используют для выделения вирусов на культуре клеток или детекции РНК методом ОТ-ПЦР.