Методические указания МУК 4.1.0.513-96 "Измерение концентраций рубомицина и доксорубицина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в воздухе рабочей зоны" (утв. Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора РФ, заместителем Главного государственного санитарного врача РФ 8 июня 1996 г.)

Методические указания МУК 4.1.0.513-96
"Измерение концентраций рубомицина и доксорубицина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в воздухе рабочей зоны"
(утв. Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора РФ, заместителем Главного государственного санитарного врача РФ 8 июня 1996 г.)

Дата введения - с момента утверждения

"Структурная формула рубомицина"

М. м. 563,7

Рубомицин (двуномицин) - {8-ацетил-10[(3-амино-2,3,6-тридеокси-L-ликсо-гексапиранозил)окси-7,8,9,1 0-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-1-метокси-5,12-нафтицендион]} - кристаллическое вещество красного цвета. Хорошо растворим в воде, водных растворах минеральных кислот. Растворим в метиловом и этиловом спиртах. Ограниченно растворим в ацетонитриле. Не растворим в хлороформе. Температура плавления - 184-186°С.

"Структурная формула доксорубицина"

М. м. 560,0

Доксорубицин (адриамицин, 14-гидроксирубомицин) - {10-/3-амино-2,3,6-тридеокси-L-ликсогексопиранозил)окси/-7,8,9,10-тетраги дро-6,9,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метокси-5,12-нафтицендион} - кристаллическое вещество красного цвета. Хорошо растворим в воде, водных растворах минеральных кислот. Растворим в метиловом и этиловом спиртах. Ограниченно растворим в ацетонитриле. Не растворим в хлороформе. Температура плавления - 185-186°С.

В воздухе находятся в виде аэрозолей.

В связи с широкой общетоксической, аллергенной, канцерогенной, мутагенной и тератогенной опасностью ПДК на рубомицин и доксорубицин не устанавливается. Рекомендуется исключить все виды контактов.

Характеристика метода

Метод основан на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением УФ-детектора.

Отбор проб производится с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения рубомицина и доксорубицина в хроматографируемом объеме пробы - 0,0125 мкг.

Нижний предел измерения концентрации рубомицина и доксорубицина в воздухе - 0,0001 (при отборе 500 л воздуха).

Диапазон измеряемых концентраций в воздухе - от 0,0001 до 0,001 .

Определению не мешает присутствие дибиомицина, доксициклина тозилата, мешает присутствие хлорметапиклина тозилата.

Суммарная погрешность измерения не превышает %.

Время выполнения анализа, включая отбор пробы, - около 80 мин.

Приборы, аппаратура, посуда

Микроклоночный жидкостей хроматограф "Милихром" или другие модели с УФ-детектором
Хроматографическая колонка длиной 120 мм, внутренним диаметром 2 мм, заполненная сорбентом "Силасорб GN" с размером зерен 7,0 мкм (Чехия)
Электроаспиратор ЭА-1	ОСТ 95.10052-84
Фильтродержатель	ТУ 95.7205-77
Роторный испаритель	ТУ 25-11-917-74
Колбы грушевидные для вакуумной разгонки, вместимостью 10-15 мл	ГОСТ 9737-70

ГАРАНТ:

Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации 21 октября 1993 г. взамен ГОСТ 9737-70 с 1 января 1995 г. принят ГОСТ 9737-93

Микроскоп отсчетный типа МПБ-2	ТУ 3-3-824-78
Стеклянная ректификационная колонна длиной 550 мм и внутренним диаметром 20 мм, флегмовое число 5 (или другая такого же типа)
Колбы мерные, вместимостью 25, 100 мл и 1 л	ГОСТ 1770-74
Пипетки вместимостью 10 мл	ГОСТ 20292-74
Пробирки с пришлифованными пробками, вместимостью 10 мл	ГОСТ 10515-75

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 10515-75 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82

Фильтры АФА-ВП-10

ТУ 85-743-80

Реактивы, растворы и материалы

Рубомицин фармакопейный, содержание основного вещества не менее 98%
Доксорубицин фармакопейный, содержание основного вещества не менее 98%
Калий марганцево-кислый (калия перманганат)	ТУ 20490-75
Ацетонитрил очищенный
Ацетонитрил очищенный получают из ацетонитрила чистого путем ректификации с предварительной химической обработкой, которая заключается в кипячении растворителя с обратным холодильником в присутствии перманганата калия из расчета 1 г перманганата калия на 1 л растворителя	ТУ 6-09-3534-82
Кипячение проводится до полного перехода перманганата калия в двуокись марганца. Перед ректификацией осадок двуокиси марганца отделяют путем фильтрации через фильтр Шотта N 4
Ректификационная колонна длиной 550 мм и внутренним диаметром 20 мм, флегмовое число 5. Насадка - спиральки Левина из нержавеющей стали (2х2х 0,2 мм)
Основную фракцию отбирают при температуре 81,6°С (атмосферное давление) в пределах колебаний °С
Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12-водный, (динатрийфосфат)	ТУ 4172-76
Калий фосфорно-кислый однозамещенный (калий фосфат)	ТУ 4198-75
0,067 М раствора динатрийфосфата готовят растворением 23,986 натрия фосфорно-кислого двузамещенного 12-водного в воде в мерной колбе вместимостью 1 л
0,067 М раствора калийфосфата готовят растворением 9,078 калия фосфорно-кислого однозамещенного в воде в мерной колбе, вместимостью 1 л
0,067 М фосфатный буфер (рН 7,2) готовят, смешивая 720 мл 0,067 М раствор динатрийфосфата и 280 мл
0,067 М раствор калийфосфата Фосфатный буфер устойчив при хранении в холодильнике в течение месяца Растворитель: 0,067 М фосфатный буфер (рН 7,2)
Элюент: 0,067 М фосфатный буфер (рН 7,2)-ацетонитрил, (4,5:1)

Стандартный раствор N 1 с концентрацией рубомицина и доксорубицина по 500 мкг/мл готовят растворением смеси 0,05 г рубомицина и 0,05 г доксорубицина растворителе в мерной колбе, вместимостью 100 мл.

Стандартный раствор N 2 с концентрацией рубомицина и доксорубицина по 10 мкг/мл каждого готовят соответствующим разбавлением стандартного раствора N 1 растворителем.

Растворы устойчивы при хранении в холодильнике в течение суток.

Отбор пробы воздуха

Воздух с объемным расходом 20 л/мин аспирируют через фильтр АФА-ВП-10. Для определения 0,0001 рубомицина или доксорубицина достаточно отобрать 500 л воздуха.

Пробы можно хранить в закрытых сосудах в холодильнике в течение месяца.

Подготовка к измерению

Хроматографические колонки промышленного изготовления.

Количественный анализ проводят методом абсолютной калибровки с использованием градуировочных растворов, которые готовят с равными концентрациями рубомицина и доксорубицина от 0,0005 до 0,005 мкг/мкл, путем соответствующего разбавления стандартного раствора N 2 растворителем.

Растворы устойчивы в течение суток при хранении в холодильнике в закрытых сосудах.

Градуировочные растворы в количестве 25 мкл инжектируют в хроматограф, вводя равные количества рубомицина и доксорубицина.

Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб:

Скорость подачи элюента (0,067 М фосфатный буфер 100 мкл/мин рН 7,2-ацетонитрил, 4,5:1)

Длина волны УФ-детектора	234 нм
Скорость движения диаграммной ленты,	1,5 мм/мин
Диапазон чувствительности детектора	0,4-08
Диапазон измерения самопишущего потенциометра	50 мВ
Объем вводимой пробы	25 мкл
Время удерживания рубомицина доксорубицина	25 мин 16 мин 30 с
Элюирующий объем рубомицина доксорубицина	2500 мкл 1650 мкл
Эффективность колонки по рубомицина доксорубицина	525 тт 470 тт

На полученной хроматограмме измеряют площади пиков и строят градуировочные графики, выражающие зависимость площади пиков () от содержания рубомицина или доксорубицина в хроматографируемом объеме (мкг).

Построение градуировочных графиков необходимо проводить не менее чем по 6 точкам, выполняя по 5 параллельных измерений для каждого инжектируемого объема. Проверку градуировочных графиков следует проводить при изменении условий анализа, но не реже 1 раза в месяц.

Проведение измерения

Фильтр с отобранной пробой помещают в пробирку с пришлифованной пробкой, добавляют 5 мл воды и оставляют на 15 мин при комнатной температуре и периодическом перемешивании. Степень десорбции с фильтра и рубомицина и доксорубицина - 98,5%.

Полученный раствор переносят в предварительно взвешенную грушевидную колбу и упаривают на роторном испарителе под вакуумом при температуре 40-45°С досуха. Сухой остаток растворяют в 0,1 мл растворителя.

25 мкл сконцентрированного раствора инжектируют в колонку хроматографа.

Хроматографирование анализируемого раствора проводят в тех же условиях по отношению к тем же элюентам, что и при построении градуировочных графиков.

Количественное определение содержания рубомицина и доксорубицина в хроматографируемом объеме проводят по предварительно построенным градуировочным графикам.

Расчет концентрации

Концентрацию рубомицина или доксорубицина С в воздухе (в ) вычисляют по формуле:

, где

а - содержание рубомицина или доксорубицина в хроматографируемом объеме пробы, найденное по соответствующему градуировочному графику, мкг;

б - объем пробы, взятой на хроматографирование, мл;

в - общий объем анализируемого раствора, мл;

V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям, л (см. приложение 1).

И. о. Председателя Госкомсанэпиднадзора России, заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации

Е.Н. Беляев