Методические указания МУК 4.1.2693-10 "Измерение массовых концентраций 3-[3-(4-бром-1,1-бифенил-4-ил)-1,2,3,4-тетрагидро-1-нафталенил]-4-гидрокс и-2Н-1-бензопиран-2-он (бродифакум) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 2 августа 2010 г.)

4.1. Методы контроля. Химические факторы

Методические указания МУК 4.1.2693-10
"Измерение массовых концентраций 3-[3-(4-бром-1,1-бифенил-4-ил)-1,2,3,4-тетрагидро-1-нафталенил]-4-гидрокс и-2Н-1-бензопиран-2-он (бродифакум) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии*"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 2 августа 2010 г.)

Дата 1 октября 2010 г.

1. Общие положения

Настоящие методические указания устанавливают методику количественного химического анализа воздуха рабочей зоны для определения в нем бродифакума методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в диапазоне массовых концентраций 0,005-0,05 . Погрешность измерений соответствует характеристикам, приведенным в табл. 1.

Методические указания аттестованы в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 с изм. N 1, 2 и ГОСТ Р ИСО 5725-2002.

Аттестация МВИ проведена во ФГУП Всероссийском научно-исследовательском институте метрологической службы Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии. Свидетельство N 66-09.

2. Характеристика вещества

2.1. Структурная формула

2.2. Эмпирическая формула

2.3 Молекулярная масса 523,45

2.4. Регистрационный номер CAS 56073-10-0

2.5. Физико-химические свойства

Бродифакум - белое кристаллическое вещество, температура плавления 228-232°С, не растворим в воде, гексане, эфире, хорошо растворим в ацетоне, хлороформе, этаноле.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.6. Токсикологическая характеристика

Бродифакум является антикоагулянтом (нарушает свертываемость крови, повышает проницаемость сосудов).

Предельно допустимая концентрация (ПДК) бродифакума в воздухе рабочей зоны 0,01 . Первый класс опасности.

3. Метрологические характеристики методики выполнения измерений

При соблюдении всех регламентных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности измерений (и ее составляющих) не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Таблица 1

Характеристики погрешности методики выполнения измерений

Диапазон измерений массовой концентрации бродифакума,	Показатель точности (границы относительной погрешности), , % при Р = 0,95	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости, r, %, Р = 0,95, n = 2	Критическая разность для результатов анализа, полученных в двух лабораториях, , % ()
От 0,005 до 0,015 вкл.	25	5	8	14	20
Св. 0,015 до 0,05 вкл.	13	3	5	8	13

4. Метод измерений

Измерение массовой концентрации бродифакума выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием

Измерение проводят при длине волны 280 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерений содержания бродифакума в анализируемом объеме пробы - 0,01 мкг.

Нижний предел измерения концентрации бродифакума в воздухе 0,005 (при отборе 80 воздуха).

Измерению не мешают сопутствующие вещества: триэтаноламин, триэтиленгликоль, а также сахар, мука.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы, растворы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Хроматограф жидкостный фирмы "Waters", США, модель М-996 с градиентной системой элюирования, автосэмплером и УФ-детектором 190-400 нм типа "диодная матрица". Колонка аналитическая, из нержавеющей стали, длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная Диасорбом-130 C-10-CN (размер частиц 7 мкм)
Аспирационное устройство ПУ 4Э ЗАО "Химко" N 14531-03 в Государственном реестре средств измерений
Весы лабораторные общего назначения модели ВЛА-200 с наибольшим пределом взвешивания 200 г	ГОСТ 24104-2001
Колбы мерные, 2-25-2, 2-100-2	ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные, 1-1-2-1, 1-1-2-2, 1-1-2-5, 1-1-2-10	ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные, 3-100	ГОСТ 1770-74
Пробирки мерные с притертыми пробками П-2-10-0,1ХС	ГОСТ 1770-74
Ротационный испаритель ИР-1М с набором колб	ТУ 25-11-917-76
Фильтродержатель,	ТУ 95-72-05-77
Фильтры бумажные обеззоленные "синяя лента" диаметр фильтра 5,5 см	ТУ 6-09-1678-77
Бюксы стеклянные СВ 19/9, СВ 24/10	ГОСТ 25336-82
Палочки стеклянные	ГОСТ 25336-82

5.2. Реактивы

Бродифакум - продукт фирмы "Cipa Agrochimica" Италия, с содержанием основного вещества не менее 95,0%, сертификационный N 02960909
Ацетонитрил, квалификации "осч" (для ВЭЖХ UV 200 нм),	ТУ 6-09-14-2167-84
О-фосфорная кислота, квалификации "хч" 85%,	ГОСТ 6552-80
Спирт метиловый, хч	ГОСТ 6995-67
Бидистиллированная вода	ТУ 6-09-2502-77
Хлороформ, ч	ТУ 6-09-4263-76

Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже приведенных в разделе 5.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

6.5. Обучение работающих безопасности труда по ГОСТ 12.0.004-90.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц, имеющих высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедших обучение и владеющих техникой хроматографического анализа, освоивших метод анализа в процессе тренировки и уложившихся в нормативы контроля.

8. Условия выполнения измерений

8.1. Процессы приготовления растворов и подготовку проб к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха ()°С,

- атмосферное давление (84-106) кПа

- относительная влажность воздуха не более 80%.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовку посуды, приготовление растворов, подготовку жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

9.1. Подготовка посуды

Стеклянную посуду ополаскивают ацетоном для удаления органических примесей, несколько раз промывают водопроводной водой, заливают хромовой смесью и выдерживают один час. После этого посуду извлекают из хромовой смеси, ополаскивают несколько раз водопроводной, а затем дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу. Чистую посуду для анализа хранят в закрытом виде.

9.2. Приготовление растворов

9.2.1. Основной стандартный раствор бродифакума в хлороформе с массовой концентрацией 1 готовят растворением г бродифакума (с учётом % содержания основного вещества) в мерной колбе вместимостью 25 . Раствор устойчив в течение трёх дней при хранении в холодильнике.

9.2.2. Рабочие стандартные растворы бродифакума N 1, 2, 3, 4, 5 и 6 с массовой концентрацией 40,0; 80,0; 160,0; 240,0; 320,0 и 400,0 готовят разбавлением основного стандартного раствора бродифакума хлороформом в мерных колбах вместимостью 25 . Объем основного стандартного раствора (V, ), необходимый для приготовления рабочих стандартных растворов бродифакума N 1, 2, 3, 4, 5 и 6 рассчитывают по формуле (1):

, где (1)

Х - массовая концентрация бродифакума в основном стандартном растворе, ;

- объем мерной колбы градуировочного раствора, ;

- рабочий стандартный раствор (N 1, 2, 3, 4, 5 и 6 с массовой концентрацией 40,0; 80,0; 160,0; 240,0; 320,0 и 400,0 )

Растворы устойчивы в течение трёх дней при хранении в холодильнике.

9.2.3. Приготовление элюента

Состав элюента: А - ацетонитрил:метанол = 1:1

В - ортофосфорная кислота 0,1%-ная (по объёму) готовят в мерной колбе вместимостью 100 следующим образом: к 99,9 бидистиллированной воды приливают 0,1 ортофосфорной кислоты.

А:В = 95:5 (по объёму)

Элюент хранят в герметичной стеклянной посуде в холодильнике в течение месяца.

9.3. Подготовка прибора

Подготовку жидкостного хроматографа проводят в соответствии с руководством по эксплуатации.

9.4. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания бродифакума в градуировочном объёме раствора, устанавливают по методу абсолютной калибровки по шести сериям растворов, по пять параллельных определений в каждой серии согласно таблице 2 следующим образом: на фильтры "синяя лента", помещённые в стаканчики, наносят по 0,1 каждого стандартного раствора с массовой концентрацией 40,0; 80,0; 160,0; 240,0; 320,0 и 400,0 , что соответствует 4,0 мкг, 8,0 мкг, 16,0 мкг, 24,0 мкг, 32,0 мкг и 40,0 мкг. После чего фильтры подсушивают при комнатной температуре, затем заливают 5,0 хлороформа и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтр отжимают, раствор сливают в пробирку, а фильтр повторно заливают 5,0 хлороформа и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтр отжимают. Экстракты объединяют. Объем растворов доводят до 10,0 хлороформом. Инжектируют в хроматограф по 0,025 каждого из градуировочных растворов.

Таблица 2

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении бродифакума

N градуировочного раствора	Объём и номер рабочих стандартных растворов бродифакума,	Объём хлороформа,	Содержание бродифакума в хроматографируемом объёме градуировочных растворов, мкг
1	0,0	10,0	0,0
2	0,1 раствор N 1	10,0	0,01
3	0,1 раствор N 2	10,0	0,02
4	0,1 раствор N 3	10,0	0,04
5	0,1 раствор N 4	10,0	0,06
6	0,1 раствор N 5	10,0	0,08
7	0,1 раствор N 6	10,0	0,1

Градуировочные растворы устойчивы в течение суток при хранении в холодильнике.

Инжектируют в хроматограф по 0,025 каждого из градуировочных растворов.

По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика () от содержания бродифакума в хроматографируемом объёме (мкг).

Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб:

Температура термостата колонки	20°С
Скорость подачи элюента	0,7
Длина волны УФ-детектора	280 нм
Объём вводимой пробы	0,025
Время удерживания бродифакума	4 мин 54 сек.

9.5. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа. Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с прописью методики.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие (2)

, (2)

где , - значение площади пика () бродифакума в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;

- норматив контроля, .

где - границы относительной погрешности, %, (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики ее устанавливают заново.

9.6. Отбор проб воздуха

Отбор проб проводят с учётом требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и Руководства Р.2.2.2006-05 (прилож. 9) "Общие методические требования к организации и проведения контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", раздел 2 Контроль соответствия максимальным ПДК.

Воздух с объёмным расходом 10 аспирируют через фильтр "синяя лента", помещённый в фильтродержатель.

Для измерения 1/2 ПДК бродифакума необходимо отобрать 80 воздуха. Фильтры с отобранной пробой хранят в бюксах в холодильнике в течение недели.

10. Выполнение измерений

После отбора пробы фильтр помещают в химический бюкс вместимостью 25 и добавляют 5,0 хлороформа, помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 15 минут, затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в другой бюкс. Фильтр повторно обрабатывают 5,0 хлороформа, снова тщательно отжимают и удаляют. Экстракты объединяют и переносят в остродонную колбу со шлифом. Колбу присоединяют к ротационному испарителю и упаривают растворитель при температуре не выше 50°С досуха. Сухой остаток в колбе растворяют в 1,0 хлороформа. Для анализа отбирают 0,025 полученного раствора. Хроматографический анализ выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой пробы.

Количественное определение бродифакума (в мкг) в анализируемом объёме раствора пробы проводят по предварительно построенной градуировочной зависимости.

11. Обработка результатов измерений

11.1. Массовую концентрацию бродифакума в воздухе рабочей зоны С, () вычисляют по формуле (3)

, где (3)

а - содержание бродифакума в анализируемом объёме раствора пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

В - общий объём раствора пробы, ; (1 )

б - хроматографируемый объем раствора пробы, ;

- объём воздуха, отобранный для анализа () и приведенного к стандартным условиям (см. прилож. 1)

11.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (4)

, где (4)

, - результаты параллельных определений массовой концентрации бродифакума в воздухе рабочей зоны, ;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (4) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

12. Оформление результатов измерения

Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

, при Р = 0,95, где

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми по 11.2, .

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

В случае, если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация бродифакума менее 0,005 (более 0,05 )".

13. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

13.1 Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

13.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

13.3 Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью по формуле (5)

, где (5)

, - средние значения массовой концентрации, полученные в первой и второй лабораториях, .

- значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6 (5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6 (5.3.4).

14. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6 и показателя правильности по 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

15. Нормы затрат времени на анализ

Для проведения серии анализов из шести проб требуется 2 часа.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

______________________________

* Методика разработана взамен МУК 4.1.1353-03, утв. 16.05.2003 Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко.