Методические указания МУК 4.1.2694-10 "Измерение массовых концентраций 2,3-дидегидро-3-деокситимидина (ставудин) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия, Главным государственным санитарным врачом РФ человека 2 августа 2010 г.)

Методические указания МУК 4.1.2694-10
"Измерение массовых концентраций 2,3-дидегидро-3-деокситимидина (ставудин) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия, Главным государственным санитарным врачом РФ человека 2 августа 2010 г.)

Дата введения: 1 октября 2010 г.

1. Общие положения

Настоящие методические указания устанавливают метод количественного химического анализа воздуха рабочей зоны для определения в нём ставудина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в диапазоне массовых концентраций 0,001 до 0,008 . Погрешность измерений соответствует характеристикам, приведенным в табл. 1.

Методика аттестована в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 (с изменениями N 1, 2), ГОСТ Р ИСО 5725-2002. Свидетельство о государственной метрологической аттестации выдано ФГУП Всероссийским научно-исследовательским институтом метрологической службы Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии (N 3-10).

2. Характеристика вещества

2.1.Структурная формула

2.2. Эмпирическая формула:

2.3. Молекулярная масса: 224,2

2.4. Регистрационный номер CAS: 3056-17-5

2.5. Физико-химические свойства

Ставудин - белый кристаллический порошок, без запаха, с температурой плавления от 167 до 174°С. Легко растворим в воде (83 ), диметилацетамиде, диметилсульфоксиде, умеренно растворим в метаноле, этаноле и ацетонитриле, мало растворим в дихлорметане, практически нерастворим в гексане.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.6. Токсикологическая характеристика

Ставудин - противоретровирусный препарат, ингибитор обратной транскриптазы вируса иммунодефицита, умеренно опасное вещество при введении в желудок, практически не токсичен при введении в брюшную полость, оказывает слабое местное раздражающее действие на кожу, обладает слабой кожно-резорбтивной и функциональной кумулятивной активностью. Ставудин обладает широким спектром побочных и отдаленных эффектов.

Контроль ставудина в воздухе рабочей зоны на уровне чувствительности не менее 0,001 , 1 класс опасности, с пометкой "++".

3. Метрологические характеристики методики выполнения измерений

При соблюдении всех регламентных условий и проведении анализа в точном соответствии с прописью методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций ставудина с метрологическими характеристиками, не превышающими значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности Р = 0,95).

Таблица 1

Метрологические характеристики методики выполнения измерений

Диапазон измерений массовой концентрации ставудина	Показатель точности (границы относительной погрешности) , % при Р = 0,95	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости, r, %, Р = 0,95, n = 2	Критическая разность для результатов анализа, полученных в двух лабораториях, , %
От 0,0010 до 0,008 вкл.	40	12	18	33	44

4. Метод измерений

Измерение массовых концентраций ставудина выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием.

Измерение проводят при длине волны 254 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр АФА-ХА-20.

Нижний предел измерения содержания ставудина в анализируемом объёме раствора пробы - 0,001 мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации ставудина в воздухе 0,001  (при отборе 1000 воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления препаративных форм на основе ставудина. Измерению не мешают сопутствующие вспомогательные вещества: лактоза, целлюлоза микрокристаллическая, крахмал, магния стеарат.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы, растворы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы, растворы.

Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Хроматограф жидкостной фирмы Perkin-Elmer Serie-200, с градиентной системой элюирования, автосэмплером и УФ-детектором 190-400 нм типа "диодная матрица"
Колонка аналитическая, заполненная обращеннофазовым сорбентом Braunlee Analitical С-18, 3 мкм (150х4,6 мм)
Аспирационное устройство, ПУ-3Э/220 ЗАО "ХИМКО", N 14531-03	в Государственном реестре средств измерений
Фильтродержатель	ТУ 95-72-05-77
Весы лабораторные ВЛА-200,	ГОСТ 24104-2001
Фильтры АФА-ХА-20	ТУ 95-1892-89
Колбы мерные, 2-25-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770-74
Пипетки, 1-1-2-1, 1-1-2-2, 1-1-2-5, 1-1-2-10	ГОСТ 29227-91
Пробирки мерные с притертыми пробками П-2-10-0,1ХС	ГОСТ 1770-74
Фильтры бумажные обеззоленные "белая лента"	ТУ 6-09-1678-77
Бюксы стеклянные СВ 19/9, СВ 24/10	ГОСТ 25336-82
Цилиндры мерные, 3-100	ГОСТ 1770-74
Палочки стеклянные,	ГОСТ 25336-82
Воронки химические, В-30-50 ХС	ГОСТ 25336-82
Иономер лабораторный типа рН-121	ГОСТ 22161-76

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

5.2. Реактивы, растворы

Ставудин с содержанием основного вещества не менее 99,0% (ЛСР-008610/09-281-009)
Ацетонитрил осч (для ВЭЖХ UV 200 нм)	ТУ 6-09-14-2167-84
О-фосфорная кислота, хч, 85% раствор, плотность  ,	ГОСТ 6552-80
Дистиллированная вода,	ГОСТ 6709-72
Состав элюента: 5% раствор ацетонитрила в водном растворе о-фосфорной кислоты (рН = 2,5) с массовой долей 0,068%.

Допускается применение других средств измерения, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими, метрологическими характеристиками и квалификацией не хуже приведенных в данном разделе.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004-90.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой хроматографического анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при проведении процедур контроля погрешности анализа.

8. Условия измерений

8.1. Процессы приготовления растворов и подготовку проб к анализу проводят в стандартных условиях при температуре воздуха ()°С, атмосферном давлении 84-106 кПа и относительной влажности воздуха не более 80%.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

9.1. Подготовка посуды

Стеклянную посуду ополаскивают ацетоном для удаления органических примесей, несколько раз промывают водопроводной водой, заливают хромовой смесью и выдерживают один час. После этого посуду извлекают из хромовой смеси, ополаскивают несколько раз водопроводной, а затем дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу. Чистую посуду для анализа хранят в закрытом виде.

9.2. Приготовление растворов

9.2.1. Основной стандартный раствор ставудина с массовой концентрацией 1000  готовят растворением () г ставудина в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 25 . Раствор устойчив в течение недели.

9.2.2. Рабочий стандартный раствор ставудина N 1 с массовой концентрацией 100 готовят разбавлением 2,5 основного стандартного раствора ставудина дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 25 . Раствор устойчив в течение недели.

9.2.3. Рабочие стандартные растворы N 2, 3, 4, 5, 6 и 7 с массовой концентрацией ставудина 10,0; 15,0; 25,0; 40,0; 50,0 и 80,0 готовят разбавлением соответственно 2,5; 3,75; 6,25; 10; 12,5; 20 рабочего стандартного раствора ставудина N 1 с массовой концентрацией 100 дистиллированной водой в мерных колбах вместимостью 25 .

Растворы устойчивы в течение недели.

9.2.4. Приготовление элюента:

В мерную колбу вместимостью 1000 вносят 0,47 85% раствора о-фосфорной кислоты, доводят до метки дистиллированной водой и получают 0,068% раствор о-фосфорной кислоты (рН = 2,5) (рН устанавливается с помощью иономера).

В мерную колбу вместимостью 100 вносят 5,0 ацетонитрила и 95 полученного 0,068% раствора о-фосфорной кислоты. Раствор дегазируют и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2-0,45 мкм.

Элюент хранят в герметичной стеклянной посуде в холодильнике в течение месяца.

9.3. Подготовка прибора

Подготовку жидкостного хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

9.4. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания ставудина в хроматографируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной калибровки по шести сериям растворов из пяти параллельных измерений согласно таблице 2 следующим образом: на фильтры АФА-ХА-20, помещённые в стаканчики, наносят по 0,1 каждого рабочего стандартного раствора (N 2, 3, 4, 5, 6 и 7) с массовой концентрацией 10,0; 15,0; 25,0; 40,0; 50,0 и 80,0 , что соответствует 1,0 мкг, 1,5 мкг, 2,5 мкг, 4,0 мкг, 5,0 мкг и 8,0 мкг. После чего фильтры подсушивают при комнатной температуре, затем заливают 5,0 дистиллированной воды и оставляют на 15 минут периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтр отжимают, раствор сливают в пробирку, а фильтр повторно заливают 5,0 дистиллированной воды и оставляют на 15 мин периодически помешивая стеклянной палочкой. Затем фильтр отжимают, раствор сливают в ту же пробирку, объём доводят до 10,0 дистиллированной водой.

Таблица 2

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении ставудина

N градуировочного раствора	Объём и номер рабочего стандартного раствора ставудина,	Объём дистиллированной воды,	Массовая концентрация ставудина в градуировочном растворе,	Содержание ставудина в хроматографируемом объёме градуировочных растворов, Мкг
1	0,0	10,0	0,0	0,0
2	0,1 раствора N 2	10,0	0,1	0,001
3	0,1 раствора N 3	10,0	0,15	0,0015
4	0,1 раствора N 4	10,0	0,25	0,0025
5	0,1 раствора N 5	10,0	0,4	0,004
6	0,1 раствора N 6	10,0	0,5	0,005
7	0,1 раствора N 7	10,0	0,8	0,008

Градуировочные растворы устойчивы в течение трёх суток.

Инжектируют в хроматограф по 0,01 каждого из градуировочных растворов.

По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика (приборные единицы) от содержания ставудина в хроматографируемом объёме (мкг).

9.5. Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб

Состав элюента:

5% раствор ацетонитрила в водном растворе о-фосфорной кислоты (рН = 2,5)

Скорость подачи элюента	1,0
Длина волны детектора	254 нм
Объём вводимой пробы	0,01
Время удерживания ставудина	11 мин 12 сек

За время удерживания ставудина принимается время удерживания пика стандарта ставудина, полученного при анализе стандартного раствора, с погрешностью %.

9.6. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце измерений и анализируют в точном соответствии с прописью методики.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

, где

, - значение площади пика (приборные единицы) ставудина в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;

- норматив контроля, ,

где - границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное измерение этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика не стабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировочной характеристики, предусмотренной методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики прибор градуируют заново.

9.7. Отбор проб воздуха

Отбор проб следует проводить с учётом требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и Руководства Р. 2.2.2006-05 (прилож. 9) "Общие методические требования к организации и проведения контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", раздел 2. Контроль соответствия максимальным ПДК.

Воздух с объёмным расходом 80 аспирируют через два параллельных канала аспирационного устройства, через фильтр АФА-ХА-20, помещенный в фильтродержатель. В патрон за фильтром устанавливают сетку. Для определения ставудина на уровне 0,001 отбирают через каждый канал 1 000 воздуха. Отобранные пробы можно хранить в бюксах в течение недели.

10. Выполнение измерений

Фильтр с отобранной пробой помещают в химический бюкс и экстрагируют 5,0 дистиллированной воды, помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 5-7 мин, затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в пробирку, а фильтр повторно экстрагируют 5,0 дистиллированной воды, снова тщательно отжимают и удаляют. Полученные растворы последовательно фильтруют с использованием химической воронки через бумажный обеззоленный фильтр "белая лента", объем доводят до 10,0 дистиллированной водой. Для анализа отбирают 0,010 полученного раствора. Хроматографический анализ выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Количественное определение содержания ставудина (в мкг) в анализируемом объеме раствора пробы проводят по предварительно построенной градуировочной характеристике.

Примечание: фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в дистиллированной воде вспомогательных веществ, входящих в состав препаративных форм ставудина.

11. Вычисление результатов измерений

Массовую концентрацию ставудина в воздухе рабочей зоны С, , вычисляют по формуле:

где:

а - содержание вещества в анализируемом объёме раствора пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

В - общий объём раствора пробы, ;

б - хроматографируемый объём раствора пробы, ;

- объем воздуха, отобранный для анализа () и приведенный к стандартным условиям (прилож. 1).

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

, где

, - результаты параллельных определений массовой концентрации ставудина в воздухе, ;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

12. Оформление результатов анализа

Результат количественного химического анализа представляют в виде:

, при Р = 0,95, где

С - среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, .

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация ставудина менее 0,001 (более 0,008 )".

13. Контроль результатов измерений

13.1. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью по формуле:

, где

, - средние значения массовой концентрации, полученные в первой и второй лабораториях, ;

- значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.4).

13.2. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

14. Нормы затрат времени на анализ

Для проведения серии анализов из шести проб требуется 3 часа 30 минут (без учёта времени отбора пробы).

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко