Методические указания МУК 4.1.256-96 "Спектрофотометрическое определение концентраций стрептодеказы в воздухе рабочей зоны" (утв. Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора РФ, заместителем Главного государственного санитарного врача РФ 8 июня 1996 г.)

Методические указания МУК 4.1.256-96
"Спектрофотометрическое определение концентраций стрептодеказы в воздухе рабочей зоны"
(утв. Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора РФ, заместителем Главного государственного санитарного врача РФ 8 июня 1996 г.)

Дата введения - с момента утверждения

Стрептодеказа

М.м. 70000-130000

n - 100 мол, % звеньев полиглюкина (ПГ); y - 24 мол. % окисленных звеньев ПГ; p - мол. % - групп стрептокиназы, модифицированной ПГ.

Белый или с желтоватым оттенком лиофилизированный порошок или пористая масса, уплотненная в таблетку. Легко растворим в воде, растворе натрия хлорида 0,9% изотонического (ГФ, х, стр. 756).

В воздухе находится в виде аэрозоля.

Проявляет сенсибилизирующие и аллергические свойства.

ПДК в воздухе - 1 .

Характеристика метода

Методика основана на использовании высокоспецифических антител к стрептодеказе, проведении реакции антиген-антитело с антителами, меченными ферментом-маркером пероксидазой, и спектрофотометрическом тестировании активности пероксидазы при длине волны 492 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения концентрации в анализируемом растворе - 0,03 мкг.

Диапазон изменяемых концентраций - от 0,12 до 1,2 .

Нижний предел измерения в воздухе - 0,12 (при отборе 50 л воздуха).

Измерению не мешают белки (бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин), ферменты (липаза Pen. solitum, L - аспарагиназа Е. coli).

Суммарная погрешность не превышает %.

Время выполнения измерений, включая отбор проб - 4 ч.

Приборы, аппаратура, посуда

Аспирационное устройство
Весы лабораторные 2-го класса точности, тип ВЛР-200: погрешность взвешивания по шкале  мг	ГОСТ 24104-88

ГАРАНТ:

См. ГОСТ Р 53228-2008 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания", утвержденный приказом Ростехрегулирования от 25 декабря 2008 г. N 739-ст

Иономер универсальный ЭВ-74: погрешность измерений

ГОСТ 22261-82

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 22261-82 постановлением Комитета РФ по стандартизации, метрологии и сертификации от 15 мая 1995 г. N 250 с 1 января 1996 г. введен в действие ГОСТ 22261-94

Дозаторы пипеточные	ТУ 64-1-3329-81
Колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-500-2, 2-1000-2, 2-го класса точности	ГОСТ 1770-74
Пипетки 6-2-5, 6-5-10	ГОСТ 20292-74
Планшеты для иммуноферментного анализа	ТУ 64-2-278-78
Считыватель АКИ-Ц-0,1	ТУ 64-16-17-89
Стаканы химические, вместимостью 0,05, 0,15, 0,2 и 1 л	ГОСТ 19980-80
Термостат суховоздушный тип ТС-8М	ТУ 64-1-1382-72
Фильтр АФА-ВП-20 с фильтродержателем	ТУ 957186-76
Холодильник бытовой	ГОСТ 26678-85
Цилиндр мерный 2-100	ГОСТ 1770-74

Реактивы, растворы, материалы

Лимонная кислота моногидрат, ч. д. а. 0,1 М раствор	ГОСТ 3652-69
Натрий фосфорнокислый однозамещенный, двухводный	ГОСТ 245-76
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, ч. д. а.	ГОСТ 11773-76
Натрий хлорид, (ГФ, X, 426) 0,85; 2,92%

Приготовление 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН . 35,5 г натрия фосфорнокислого двузамещенного растворяют в 1000 мл дистиллированной воды в мерной колбе, вместимостью 1000 мл.

4 г натрия фосфорнокислого однозамещенного растворяют 250 мл воды в мерной колбе, вместимостью 250 мл.

1000 мл раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного и 250 мл раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного смешивают в стакане, вместимостью 2000 мл.

Раствор хранится в течение 2 месяцев в холодильнике.

Приготовление буфера "А". 1000 мл фосфатного буферного раствора рН 7,2 смешивают с 8,47 г хлористого натрия. Раствор хранят в холодильнике в течение 2 месяцев.

Твин-20 "Серва", ФРГ.

Приготовление буфера "В". К 1000 мл раствора фосфатного буфера рН прибавляют 29,2 г хлористого натрия и 1 мл твина-20. Раствор хранят в холодильнике в течение 2 месяцев.

Приготовление 0,1 моль/л фосфатно-цитратного буферного раствора рН . В мерную колбу, вместимостью 1000 мл, вносят 7,3 г лимонной кислоты (моногидрат) и 9,47 г натрия фосфорно - кислого однозамещенного безводного и доводят раствор до метки дистиллированной водой при перемешивании. Раствор хранят при температуре -10°С в течение 6 месяцев.

О-фенилендиамин, х. ч., 0,04%-ный раствор ТУ 6-09-5880-69

Приготовление 0,04% раствора о-фенилендиамина. Навеску 10 г о-фенилендиамина растворяют в 24 мл фосфатноцитратного буфера в стакане, вместимостью 50 мл. Раствор готовят непосредственно перед измерением.

Перекись водорода

ГОСТ 10929-76

Приготовление раствора субстратной смеси. К 24 мл раствора о-фенилендиамина прибавляют дозатором, вместимостью 20 мкл, 14 мкл концентрированной перекиси водорода. Смесь готовят непосредственно перед измерениями.

Стрептодеказа раствора с = 0,6 мкг/мл, С = 0,12 мкг/мл

ФС 42-2471-87

Приготовление основного раствора стрептодеказы с концентрацией 0,6 мкг/мл. Точную навеску 25 мг (7,2% белка) стрептодеказы растворяют в 6 мл дистиллированной воды. Массовая концентрация стрептодеказы в полученном растворе составляет 0,30 мг/мл. Из полученного раствора отбирают 1 мл дозатором на 1 мл и вносят в мерную колбу, вместимостью 500 мл. Объем доводят до метки дистиллированной водой.

Используют свежеприготовленный раствор.

Приготовление раствора стрептодеказы с концентрацией 0,12 мкг/мл. 5 мл основного раствора стрептодеказы пипеткой, вместимостью 5 мл, переносят в мерную колбу, вместимостью 25 мл. Объем доводят до метки буфером "А". Используют свежеприготовленный раствор.

Серная кислота, х. ч., концентрированная 4М раствор

ГОСТ 4204-77

Приготовление 4М раствора серной кислоты. К 8,5 дистиллированной воды, используя пипетку, вместимостью 1 мл, добавляют 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Раствор хранят при комнатной температуре.

Антисыворотка к стрептодеказе, ВНИТИАФ

Приготовление раствора антисыворотки. Содержимое флакона с лиофилизированной антисывороткой к стрептодеказе растворяют в 5 мл буфера "В", используя пипетку, вместимостью 5 мл.

Далее из полученного раствора отбирают 0,5 мл дозатором на 1 мл и переносят в мерную колбу, вместимостью 500 мл, доводят объем до метки буфером "В". Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

Подготовка сенсибилизированного планшета. Раствор стрептодеказы с концентрацией 0,12 мкг/мл заливают дозатором, вместимостью 0,2 мл по 0,2 мл во все лунки (кроме А1) полистиролового планшета для ИФА. Планшет закрывают крышкой и выдерживают 18 часов в холодильнике. Из лунок выливают раствор стрептодеказы и промывают 4 раза буфером "В" с помощью полуавтоматической промывалки.

Сенсибилизированный таким образом планшет используют в анализе или запаивают в полиэтиленовый мешок и хранят в холодильнике в течение 3 месяцев. Антитела диагностические против иммуноглобулинов кролика, меченные пероксидазой, ВФС 42-8-ВС-85, (антивидовой коньюгат)

Приготовление раствора антивидового конъюгата. Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 мл буфера "В", используя пипетку, вместимостью 10 мл. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

Отбор пробы воздуха

Воздух с объемным расходом 10 л/мин аспирируют через фильтр АФА-ВП-20, закрепленный в фильтродержателе. Для измерения 1/2 ПДК достаточно отобрать 50 л воздуха. Пробы хранят менее суток.

Подготовка к выполнению измерений

Градуировочный раствор готовят согласно таблице. Хранят в холодильнике не более 3 суток.

Таблица

Шкала градуировочных растворов

N стандартов	Основной р-р стрептодеказы, мл	Вода, мл	Концентрация стрептодеказы в градуировочном р-ре, мкг/мл
1	0,2	0,2	0,300
2	0,2	0,6	0,150
3	0,2	1,4	0,080
4	0,2	2,8	0,040
5	0,2	3,8	0,030
6	0,2	5,8	0,020

Проведение анализа

1. Во все промытые, не содержащие раствор лунки (кроме А1) предварительно сенсибилизированного планшета, заливают с помощью дозатора на 0,1 мл по 0,1 мл раствора антисыворотки, затем в лунки В1, С1 заливают по 0,1 мл буфера "В", в лунки 2-7 рядов А, В, С - по 0,1 мл градуировочных растворов. Для каждого стандартного раствора отводят по 3 лунки. Во всех лунках общий объем составляет 0,2 мл, лунка А1 остается пустой.

Планшет закрывают крышкой и инкубируют 1,5 ч при температуре 37°С.

2. Выливают содержимое планшета и промывают его 4 раза буфером "В".

3. Во все лунки (кроме А1) вносят по 0,2 мл раствора антивидового конъюгата, закрывают планшет крышкой и инкубируют 1,5 ч при температуре 37°С.

4. Четырехкратная промывка по п. 2.

5. Проведение ферментативной реакции.

В каждую лунку вносят дозатором на 0,1 мл по 0,1 мл раствора с субстратной смесью. Инкубируют по секундомеру 10 мин. Затем в той же последовательности в лунки вносят дозатором на 0,2 мл по 0,075 мл раствора 4М серной кислоты для остановки реакции.

6. Для измерения оптической плотности растворов в лунках планшет помещают в рамку считывателя АКИ.Ц.0,1. Измерение проводят при длине волны 492 нм, причем в качестве раствора сравнения используют раствор субстратной смеси в лунке А1.

Строят градуировочный график. На масштабно-координатной бумаге по оси абсцисс откладывают концентрацию стрептодеказы в градуировочных растворах в единицах концентрации (мкг/мл), а по оси ординат - значение оптической плотности при длине волны 492 нм. Градуировочный график строят одновременно с проведением измерений в пробах.

Проведение измерения

После отбора пробы воздуха фильтры АФА-ВП-20 помещают в стаканы, вместимостью 50 мл, и приливают 20 мл буфера "А", периодически встряхивая, выдерживают в течение 10 мин. Затем с помощью дозатора на 1 мл отбирают 1 мл раствора и переносят в мерную колбу, вместимостью 50 мл, объем доводят до метки буфером "В".

Анализ проводят аналогично процедуре при построении калибровочной зависимости.

Растворы могут храниться до проведения анализа в течение 2 суток в холодильнике.

По градуировочному графику на основании измерения значений оптической плотности в растворах проб определяют соответствующие концентрации стрептодеказы в пробах (мкг/мл).

Расчет концентрации

Концентрацию стрептодеказы (С) в воздухе () вычисляют по формуле:

, где

а - концентрация стрептодеказы в анализируемом растворе, мкг;

в - общий объем анализируемого раствора, мл;

V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям, л (см. приложение 1).

К - коэффициент десорбции вещества с фильтра, равный 0,85.

И. о. Председателя Госкомсанэпиднадзора России - заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации

Г.Г. Онищенко