Методические указания МУК 4.1.2252-07 "Измерение массовых концентраций суммы стероидных сапонинов Юкки Шидигера в воздухе рабочей зоны методом хромато-масс-спектрометрии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 17 августа 2007 г.)

Методические указания МУК 4.1.2252-07
"Измерение массовых концентраций суммы стероидных сапонинов Юкки Шидигера в воздухе рабочей зоны методом хромато-масс-спектрометрии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 17 августа 2007 г.)

Дата введения: с момента утверждения

1. Область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику количественного химического анализа воздуха рабочей зоны для определения в нем массовых концентраций суммы стероидных сапонинов Юкки Шидигера (далее по тексту сапонины Юкки) методом хромато-масс-спектрометрии в диапазоне массовых концентраций от 2,0 до 34 .

2. Характеристика вещества

2.1. Название и структура

Сапонины Юкки представляют собой сумму стероидных гликозидов ряда спиростана и фуростана, выделенных из растительного сырья. Растительным сырьем для получения сапонинов служит холодный экстракт различных частей растений, относящихся к виду Юкка Шидигера. Большая часть сапонинов выделена в чистом виде и охарактеризована.

Состав экстракта сапонинов Юкки представлен в табл. 1.

Таблица 1

Состав экстракта сапонинов Юкки

Сапонины N п/п	Эмпирическая формула	Молекулярная масса сапонина	Доля по отношению к общему количеству сапонинов в препарате, %	Молекулярная масса агликона (сапогинина)
1		886	24,0	432
2		739	66,0	417
3		871		417
4		915,5	0,1	416
5		755	3,1	433
6		919	6,8	435
7		1049,5		435
8		1047,5		433

Название сапонинов Юкки по ИЮПАК:

N 1. 3-O--D-глюкопиранозил-()-[-D-ксилопиранозил-()]--D-глюкопи ранозил-5(25R)-спиростан-3-ол-12-он

N 2. 3-O--D-глюкопиранозил-()--D-глюкопиранозил-5(25S)-спиростан -3-ол

N 3. 3-O--D-глюкопиранозил-()-[-D-ксилопиранозил-()]--D-глюкопи ранозил-5(25S)-спиростан-3-ол

N 4. 3-O--D-глюкопиранозил-()-[-D-глюкопиранозил-()]--D-глюкопиранозил-5 (25R)-спиростан-5-ол-12-он

N 5. 3-O--D-глюкопиранозил-()--D-галактопиранозил-5-D(25S)-спиро стан-2,3-диол

N 6. 3-O--D-глюкопиранозил-()--D-глюкопиранозил-5-D(25R)-фуроста н-3,22,26-триол 26-O--D-глюкопиранозид

N 7. 3-O--D-глюкопиранозил-()-[-D-ксилопиранозил-()]--D-глюкопи ранозил-5(25R)-фуростан-3,22,26-триол 26-O--D-глюкопиранозид

N 8. 3-O--D-глюкопиранозил-()-[-D-ксилопиранозил-()]--D-глюкопи ранозил-(25R)-фурост20(22)-ен3,26-диол-12-он 26-О--D-глюкопиранозид.

Структурные формулы сапонинов Юкки:

N 1. R-3-O--D-глюкопиранозил-()-[-D-ксилопиранозил-()]--D-глюко пиранозил

N 4. R-3-O--D-глюкопиранозил-()-[-D-глюкопиранозил-()]--D-глюко пиранозил

N 2. R-3-O--D-глюкопиранозил-()--D-глюкопиранозил, -H

N 3. R-3-O--D-глюкопиранозил-()-[-D-ксилопиранозил-()]--D-глюко пиранозил, -H;

N 5. R-3-O--D-глюкопиранозил-()--D-галактопиранозил; -ОH

N 6. R-3-O--D-глюкопиранозил-()--D-глюкопиранозил; --D-глюкониранозил

N 7. R-3-O--D-глюкопиранозил-()-[-D-ксилопиранозил-()]--D-глюко пиранозил; --D-глюкопиранозил

N 8. R-3-O--D-глюкопиранозил-()-[-D-ксилопиранозил-()]--D-глюко пиранозил, --D-глюкопиранозил

2.2. Физико-химические свойства

Сапонины Юкки представляют собой бесцветные или желтоватые кристаллические или аморфные вещества с высокой температурой плавления (плавятся с разложением); хорошо растворимы в воде, плохо - в этаноле, лучше - в метаноле, нерастворимы в бензоле, хлороформе и диэтиловом эфире. Отдельные свойства представлены в табл. 2.

Таблица 2

Физико-химические свойства сапонинов Юкки

Сапонины	Температура плавления, °С	Удельное вращение плоскости поляризации, (метанол, с = 0,1)
1	197-198	-15,2
2	260-261	-48,0
3	298-299	-40,6
4	234-236	-7,8
5	273-274	-45,8
6	207-208	-38,8
7	235-236	-43,3
8	193-195	-3,6

Экстракт сапонинов Юкки представляет собой вязкую жидкость темно-коричневого цвета (поглощение 10%-го раствора при 520 нм - 1,63), рН = 4,0, удельный вес 1,21-1,24, общее количество растворенных веществ - 45-48 брикс, содержание сапонинов Юкки - 10-12%.

Агрегатное состояние в воздухе - в виде капельно-жидкого аэрозоля.

2.3. Токсикологическая характеристика

Экстракт сапонинов Юкки не обладает кумулятивным и сенсибилизирующим действиями. Ввиду низкой токсичности, вещества не подлежат нормированию.

3. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышают значений, представленных в табл. 3 и 4.

Таблица 3

Диапазон измерений, значения показателей повторяемости, воспроизводимости, правильности и точности

Диапазон измерений,	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратичное отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), , %	Показатель правильности (границы относительной систематической погрешности методики при доверительной вероятности Р = 0,95), , %	Показатель точности (границы относительной погрешности методики при доверительной вероятности Р = 0,95), , %
Сумма сапонинов Юкки от 2,0 до 34,0	11	14	11	32

4. Метод измерений

Измерение массовой концентрации суммы сапонинов Юкки в воздухе рабочей зоны выполняется методом хромато-масс-спектрометрии с предварительным улавливанием анализируемого вещества из воздуха на аэрозольные фильтры АФА-ХА-20, последующей экстракцией содержимого фильтров и кислотным гидролизом этого содержимого.

В основе метода количественного определения суммы сапонинов Юкки лежит определение продуктов их кислотного гидролиза - агликонов (сапогенинов), гомологов спиростана, представленных тремя основными веществами - сарсасапогенином ((25S)-5 -спиростан-3-ол), глориогенином ((25R)-5-спиростан-3-ол-12-он) и маркогенином ((25S)-5-спиростан-2,3-диол), с предварительной масс-спектрометрической идентификацией этих и подобных им веществ. Три названные вещества составляют 93-94% от общего количества сапогенинов Юкки Шидигера.

Нижний предел измерения концентрации суммы сапогенинов в градуировочном растворе пробы при доверительной вероятности Р = 0,95 составляет 5,9 .

Нижний предел измерения массовых концентраций суммы сапонинов Юкки в воздухе составляет 2,0 при отборе 150 воздуха.

Определению суммы сапонинов Юкки в воздухе не мешают ингредиенты, используемые при производстве органических биоразлагаемых продуктов (ОБП) - бензоат натрия, лимонная кислота, ПАВ, лимонен.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы.

5.1. Средства измерений

Хромато-масс-спектрометр "PolarisQ" фирмы "ThermoFinnigan", включающий в себя: масс-спектрометр с анализатором - ионной ловушкой и внешним ионным источником; газовый хроматограф "Trace GC"; колонку "Thermo TR-5ms" длиной 25 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной слоя фазы 0,25 мкм и жидкой фазой - "(5% фенил)-диметилполисилоксан"; систему обработки данных "";
библиотеку масс-спектров NIST 02.	N 28566-05 в Государственном реестре средств измерений
Весы аналитические ВЛР-200	ГОСТ 24104-2001
Пробоотборное устройство ПУ-2П	N 14531-03 в Государственном реестре средств измерений
Термометр лабораторный	ГОСТ 28498-90
Барометр	ГОСТ 23696-79
Колбы мерные 2-1000-2; 2-500-2; 2-200-2; 2-100-2; 2-50-2; 2-25-2	ГОСТ 25336-82
Автоматическая пипетка-степпер 10-5000 мкл "TermoLabsystems" - "Ленпипет" с набором комбитипов объема 1,25 и 5,0	ГОСТ 28311-89
Цилиндры мерные 3-10 и 3-25	ГОСТ 1770-74
Микрошприц МШ-10	ТУ-2.833.105

5.2. Вспомогательные устройства

Насос вакуумный мембранный "ВН-3.0"	ГОСТ 15150-69
Сушильный шкаф ШСС-80	ГОСТ 20790-93
Мешалка магнитная ММ-5	ТУ 25-11.834-80
Аналитические аэрозольные фильтры АФА-ХА-20, площадь поверхности 20 , производство - ФГУП В/О "Изотоп")	ТУ 95-1892-89
Фильтродержатели открытые ИРА 20-2 (производство - ФГУП В/О "Изотоп")	ТУ 95-1021-82
Колбы конические плоскодонные КП-1-100-14/23 ТС	ГОСТ 25336-82
Пинцет медицинский	ГОСТ 21241-77
Колба коническая КН-1-100-29/32	ТУ 92-891.029-91
Холодильник ХШ-1-300-29-14	ГОСТ 25336-82
Флаконы из темного стекла с силиконовыми пробками, тефлоновыми прокладками, завинчивающимися пробками вместимостью 14 "Supelco"
Электроплитка с закрытой спиралью	ГОСТ 14919-83
Воронка делительная ВД-3-100	ГОСТ 25336-82

5.3. Материалы и реактивы

Метилен хлорид	ГОСТ 9968-86
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72
Соляная кислота, ОСЧ	ГОСТ 14261-77
Натрий сернокислый безводный, ЧДА	ГОСТ 4166-76
Стандартный образец - диосгенин (сарсапогенин), "Fluka" (99%)	Lot 1272227 Filling code 40906254
Гелий, СПЧ (99,999%), марка "55"	ТУ 2114-001-45905715-02

Допускается применение других средств измерения и вспомогательных устройств, метрологические и технические характеристики которых не ниже вышеуказанных.

6. Требования безопасности

6.1. При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами ГОСТ 12.04.021-76.

6.2. При работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности по ГОСТ 12.1.019-79 и требования, изложенные в технической документации на использование приборов.

6.3. Организация обучения по безопасности труда осуществляется по ГОСТ 12.1.004-91.

6.4. Помещение должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.0.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо ГОСТ 12.0.004-91 имеется в виду ГОСТ 12.0.004-90

7. Требовании к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц, имеющих высшее инженерное, химическое специальное образование, владеющих методом хромато-масс-спектрометрии, знающих принцип действия, конструкцию и правила эксплуатации используемого оборудования.

К выполнению работ по отбору проб и пробоподготовке допускают лиц, имеющих квалификацию техника-химика, обученных методике подготовки проб для выполнения последующего хромато-масс-спектрометрического анализа.

8. Условия измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

Температура воздуха, °С
Атмосферное давление, кПа (мм. рт. ст.)	84,0-109,7 (630-800)
Относительная влажность воздуха, %	не более 80
Напряжение в электросети, В
Частота переменного тока, Гц

9. Подготовка к выполнению измерений

Перед проведением измерений проводят следующие работы: подготовка лабораторной посуды, проверка работоспособности хромато-масс-спектрометра, приготовление растворов (стандартного образца и градуировочных), установление градуировочной характеристики, отбор проб.

9.1. Подготовка посуды

При выполнении измерений необходимо использовать чистую химическую посуду. Посуду обезжиривают ацетоном, после чего ее многократно ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу при 120°С.

9.2. Подготовка хромато-масс-спектрометра

Подготовку хромато-масс-спектрометра и системы обработки данных проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

9.3. Приготовление растворов

9.3.1. Приготовление основного раствора стандартного образца диосгенина от компании "Fluka" (п. 5.3. Материалы и реактивы) с массовой концентрацией 594,0 .

Навеску диосгенина 59,40 мг, взятую на аналитических весах, переносят в мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 . Навеску растворяют в хлористом метилене, доводя объем раствора до метки. Раствор хранят в колбе не более 7 суток в холодильнике при +4°С.

Абсолютная погрешность концентрации раствора стандартного образца по процедуре приготовления не превышает 0,6 (приложение, п. 1).

9.3.2. Приготовление градуировочных растворов.

Градуировочные растворы с массовой концентрацией в диапазоне 5,94-237,6 готовят разведением основного раствора стандартного образца диосгенина с концентрацией 594,0 хлористым метиленом в 100, 40, 20, 10, 5 и 2,5 раза, в мерных колбах на 25 с использованием пипетки-степпера 10-5000 "TermoLabsystems" - "Ленпипет" (таблица 5).

Градуировочные растворы могут храниться в течение 2-х суток при комнатной температуре в стеклянных колбах с притертой пробкой.

Таблица 4

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении сапонинов Юкки

N раствора	Объем основного стандартного раствора диосгенина с массовой концентрацией С = 594,0 ,	Концентрация диосгенина без учета погрешности приготовления растворов,	Содержание диосгенина в хроматографируемом объеме пробы, мкг
1	0,000	0,00	0,000
2	0,250	5,94	0,006
3	0,625	14,85	0,014
4	1,250	29,70	0,029
5	2,500	59,40	0,059
6	5,000	118,80	0,119
7	10,000	237,60	0,238

9.4. Установление градуировочной характеристики

9.4.1. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика диосгенина (в условных единицах) от его концентрации (), строят с использованием градуировочных растворов, приготовленных в соответствии с таблицей 4.

Для установления градуировочной характеристики отбирают микрошприцем установленное количество каждого из градуировочных растворов, приготовленных по п. 9.3.2 и вводят в инжекторное устройство хромато-масс-спектрометра.

9.4.2. Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб:

Температурная программа	80°С изотерма 2 мин, далее программируемый нагрев до 320°С со скоростью 20°С/мин и изотерма 5 мин при 320°С
Условия инжекции	инжектор без деления потока, температура инжектора 275°С
Объем вводимой пробы	0,001
Газ носитель	гелий со скоростью 1
Время удерживания диосгенина	17,39 мин
Регистрация масс-спектров	в положительных ионах в диапазоне 30-600 m/z
Тип ионизации	электронный удар, стандартные условия
Идентификация веществ	по библиотеке масс-спектров NIST 02
Оценка площадей пиков	по полному ионному току

Рис. 1 - Хроматограмма стандартного образца диосгенина

Для установления градуировочной характеристики каждый раствор и холостую пробу хроматографируют не менее 5 раз. Градуировочный график в этом случае строится с учетом усредненных значений площадей пика.

9.4.3. Контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляют еженедельно, а также при использовании новых реактивов и растворов. Градуировочная характеристика считается стабильной при выполнении для каждого образца градуировочных растворов следующего условия:

, где (1)

X - результат контрольного измерения массовой концентрации в образце для градуировки, ;

Сгр. - аттестованное значение массовой концентрации диосгенина в образце для градуировки, ;

- среднеквадратичное отклонение внутрилабораторной прецизионности измерений, установленное при реализации методики в лаборатории, %.

Допустимо среднеквадратическое отклонение внутрилабораторной прецизионности измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: , с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Значение составляет 1,6-5,1% в пределах градуировочной характеристики.

В случае невыполнения данного условия, градуировочная характеристика строится заново.

9.5. Отбор проб воздуха

9.5.1. Отбор проб воздуха следует проводить с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и Руководства Р 2.2.2006-05 (прилож. 9, обязательное) "Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", п. 2 Контроль соответствия максимальным ПДК.

Воздух с объемным расходом 15 аспирируют через фильтры АФА-ХА-20, помещенные в фильтродержатель ИРА 20-2. Для определения нижнего предела массовой концентрации сапонинов Юкки в воздухе рабочей зоны достаточно отобрать 150 воздуха. После отбора пробы воздуха фильтр извлекают пинцетом и помещают на дно конической колбы КН-1-100-29/32 объемом 100 с пришлифованной пробкой.

9.5.2. Срок хранения проб - не более 3 суток в защищенном от света месте при °С.

10. Выполнение измерений

10.1. В колбу с фильтром (п. 9.5.1) приливают 15 дистиллированной воды. Затем проводят экстракцию вещества с фильтра на магнитной мешалке со скоростью 150 об./мин в течение 20 мин. Жидкость переносят в коническую колбу КН-1-100-29/32 вместимостью 100 с обратным холодильником и дважды проводят дополнительную обработку фильтра свежими порциями дистиллированной воды. Три порции дистиллированной воды по 15 объединяют в конической колбе KН-1-100-29/32 объемом 100 с обратным холодильником.

10.2. Для проведения кислотного гидролиза в коническую колбу КН-1-100-29/32 с обратным холодильником добавляют 5 соляной кислоты и помещают на электроплитку с закрытой спиралью. Смесь в колбе кипятят с обратным холодильником 4 часа. Затем охлаждают до комнатной температуры и количественно переносят в делительную воронку. Добавляют в воронку 7 хлористого метилена и энергично встряхивают. После расслоения жидкости в воронке, нижний, органический слой сливают в мерную колбу на 25 , и повторяют процедуру экстракции еще дважды, объединяя порции хлористого метилена в мерной колбе на 25 . Доводят объем содержимого колбы до 25 хлористым метиленом, затем добавляют в колбу 1 г безводного сульфата натрия для осушения экстракта и помещают колбу в темное место на 1 час. Через час содержимое колбы переносится для хранения во флаконы вместимостью 14 , из темного стекла с герметично закрывающимися крышками, снабженными силиконовыми уплотнителями с тефлоновыми прокладками. Флаконы передают в лабораторию для хромато-масс-спектрометрического анализа. Срок хранения проб - не более 7 суток при °С.

Хромато-масс-спектрометрический анализ проб проводят в условиях, соответствующих п. 9.4.2.

Для оценки общего количества сапогенинов в пробе вычисляется сумма площадей 3-х пиков. По градуировочной характеристике, п. 9.4, находят общее количество сапогенинов.

10.3. Для перехода от содержания сапогенинов в пробе к сумме сапонинов в растворе, полученном в п. 10.1, применяется пересчетный коэффициент - К, учитывающий молекулярные массы сапогенинов и сапонинов Юкки и массовое соотношение отдельных сапонинов в экстракте Юкки:

, (2)

В числителе находится средняя молекулярная масса сапонинов, в знаменателе - средняя молекулярная масса сапогенинов с учетом нормировки по содержанию сапонинов в пробе.

С учетом данных, приведенных в табл. 1, К принимает значение, равное 1,99.

10.4. Содержание суммы сапонинов Юкки [мг] в растворе, полученном в п. 10.1, вычисляют по формуле:

, где (3)

- концентрация сапогенинов в минерализате, полученная по градуировочной характеристике, , 1000 - коэффициент пересчета мкг в мг.

11. Вычисление результатов измерений

11.1. Концентрацию суммы сапонинов Юкки "С ()" в воздухе вычисляют по формуле:

, где (4)

- содержание суммы сапонинов Юкки, из формулы (1), мг;

1000 - коэффициент пересчета в ;

- объем воздуха, отобранный для анализа, приведенный к стандартным условиям, (см. прилож. 1).

11.2. За результат измерения массовой концентрации суммы сапонинов Юкки в воздухе рабочей зоны принимают среднее арифметическое значение "п" (двух) результатов измерений и , полученных в условиях повторяемости

, (5)

для которых выполняется следующее условие:

, где (6)

r - предел повторяемости, значения которого приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (6) необходимо дополнительно получить еще два результата измерений.

Если при этом размах () четырех результатов измерений равен или меньше по значению критического диапазона для уровня значимости 95% , то в качестве окончательного результата принимают среднее арифметическое значение результатов четырех измерений. Коэффициенты критического диапазона f(n) представлены в табл. 3 ГОСТ Р ИСО 5725-2002, часть 6 и предназначены для использования в расчетах критического диапазона согласно равенству:

, (для n = 4, f(n) = 3,6) (7)

Если диапазон результатов четырех измерений больше критического диапазона для n = 4, то в качестве окончательного результата должна фиксироваться медиана результатов четырех измерений.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений массовой концентрации суммы сапонинов Юкки оформляют протоколом в виде:

, где (8)

- среднее арифметическое значение результатов n (двух) определений, признанных приемлемыми (п. 11.2), ;

- границы относительной погрешности, %, значение которой приведено в таблице 3.

В случае, если содержание массовой концентрации суммы сапонинов Юкки в воздухе рабочей зоны ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, отчет представляют в форме "массовая концентрация суммы сапонинов Юкки в воздухе рабочей зоны ниже 2,0 (выше 34,0 )".

13. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории

Периодичность контроля стабильности результатов выполненных измерений регламентируется в Руководстве по качеству лаборатории.

Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002, используя метод контроля стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.

Рекомендуется устанавливать контрольный период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе, проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

14. Нормы затрат времени на анализ

Для проведения серии анализов из 5 проб воздуха с учетом дублирования каждой пробы согласно п. 11.2, при условии отсутствия этапа хранения проб и при технической возможности проведения параллельной пробоподготовки 10-ти проб (п. 10.1. и п. 10.2), требуется 14 ч.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко