Методические указания МУК 4.1.1652-03 "Спектрофотометрическое измерение массовых концентраций N-[4-[[(2,4-диамино-6-птеридинил)метил] метиламино] бензоил]-L-глютаминовой кислоты (метотрексат) в воздухе рабочей зоны" (утв. Министерством здравоохранения РФ 29 июня 2003 г.)

Методические указания МУК 4.1.1652-03
"Спектрофотометрическое измерение массовых концентраций N-[4-[[(2,4-диамино-6-птеридинил)метил] метиламино] бензоил]-L-глютаминовой кислоты (метотрексат) в воздухе рабочей зоны"
(утв. Министерством здравоохранения РФ 29 июня 2003 г.)

Дата введения: 29 июня 2003 г.

1. Область применения

Настоящие методические указания устанавливают количественный спектрофотометрический анализ воздуха рабочей зоны на содержание метотрексата в диапазоне массовых концентраций 0,001 - 0,020 .

2. Характеристика вещества

2.1. Структурная формула.

2.2. Эмпирическая формула .

2.3. Молекулярная масса 454,45.

2.4. Регистрационный номер CAS 59-05-2.

2.5. Физико-химические свойства.

Метотрексат - желтый или оранжево-желтый мелкокристаллический порошок с температурой плавления 205°С (разлож.). Практически нерастворим в воде и этиловом спирте, нерастворим в ацетоне, бензоле, метаноле, эфире, хлороформе, слаборастворим в диметилформамиде, водных растворах минеральных кислот. Растворим в разведенных растворах щелочей и карбонатов щелочных металлов. Гигроскопичен и неустойчив к действию света.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.6. Токсикологическая характеристика.

Метотрексат - цитостатический препарат из класса антиметаболитов, структурный аналог фолиевой кислоты, обладает противоопухолевой активностью, используется также для лечения широкого круга иммуновоспалительных заболеваний. Метотрексат высокоопасен при введении внутрь, аппликации на кожу и парентеральных путях поступления, обладает сверхкумулятивной активностью. Легко проникает через неповрежденные кожные покровы, оказывая выраженное системное токсическое действие на организм, обладает иммунодепрессивным, мутагенным и канцерогенным действием.

Контроль метотрексата в воздухе рабочей зоны на уровне чувствительности не менее 0,001 ; класс опасности - первый, с пометкой "++".

3. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций метотрексата с погрешностью, не превышающей %, при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Измерения массовой концентрации метотрексата выполняют методом спектрофотометрии.

Метод определения основан на способности растворов метотрексата в 0,1 н водном растворе гидроксида натрия поглощать УФ-излучение.

Измерение проводят при длине волны 303 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения содержания метотрексата в анализируемом объеме пробы - 4,0 мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации метотрексата в воздухе рабочей зоны - 0,001 (при отборе 4 000 воздуха).

Метод специфичен в условиях производства лекарственной формы метотрексата для инъекций (порошок лиофилизированный во флаконах).

Определению не мешают вспомогательные компоненты: натр едкий, нипагин и нипазол, входящие в лекарственную форму для инъекций.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы, растворы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и растворы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Спектрофотометр Specord M-40, Carl Zeiss
Весы лабораторные ВЛА-200	ГОСТ 24104-88Е
Аспирационное устройство, ПУ-3Э/220 НПФ "НОРД-ЭКОЛОГИЯ ХИМАВТОМАТИКА"	ТУ ЕВКН 4.471.000
Фильтры АФА-ВП-10	ТУ 95-743-80
Колбы мерные, вместимостью 25, 100, 1 000	ГОСТ 1770-74Е
Пипетки, вместимостью 1, 2, 5, 10	ГОСТ 29227-91
Пробирки мерные с пришлифованными пробками, вместимостью 10	ГОСТ 25336-82Е
Бюксы химические с пришлифованными крышками, вместимостью 25	ГОСТ 25336-82Е
Фильтры бумажные обеззоленнные "белая лента", диаметром 5,5 см	ТУ 6-09-1678-77
Воронки химические, диаметром 30 мм	ГОСТ 25336-82Е
Палочки стеклянные	ГОСТ 25336-82Е
Кюветы с толщиной оптического слоя 20 мм
Дистиллятор	ТУ 61-1-721-79

5.2. Реактивы, растворы

Метотрексат с содержанием основного вещества не менее 99,0% в пересчете на сухое вещество	ФС 42-1592-88
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72
Натрия гидроксид, хч, 0,1 н водный раствор	ГОСТ 4328-77

Допускается применение иных средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками и квалификацией, не хуже приведенных в данном разделе.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

6.3. При выполнении измерений с использованием спектрофотометра соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие обучение и имеющие навыки работы на спектрофотометре.

8. Условия измерений

8.1. Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха ()°С, атмосферном давлении 84 - 106 кПа и относительной влажности воздуха не более 80%.

8.2. Выполнение измерений на спектрофотометре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовку спектрофотометра, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

9.1. Приготовление растворов

9.1.1. Основной стандартный раствор метотрексата с концентрацией 500 готовят растворением 0,0550 г вещества в 0,1 н водном растворе гидроксида натрия в мерной колбе вместимостью 100 . Раствор применяют свежеприготовленным.

9.1.2. Стандартный раствор метотрексата N 1 с концентрацией 20 готовят разбавлением 1  основного стандартного раствора 0,1 н водным раствором гидрокисида натрия в мерной колбе вместимостью 25 . Раствор применяют свежеприготовленным.

9.1.3. Стандартный раствор метотрексата N 2 с концентрацией 4 готовят разбавлением 5  стандартного раствора N 1 0,1 н водным раствором гидроксида натрия в мерной колбе вместимостью 25 . Раствор применяют свежеприготовленным.

9.1.4. Приготовление 0,1 н водного раствора натрия гидроокиси: 4,0 г едкого натра растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1 000 . Раствор хранят в течение двух недель.

Примечание. Все операции, связанные с проведением анализа, следует проводить как можно быстрее в защищенном от света месте.

9.2. Подготовка прибора

Подготовку спектрофотометра проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

9.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость оптической плотности раствора от массы метотрексата, устанавливают по шести сериям растворов из пяти параллельных определений в каждой серии растворов для градуировки согласно табл. 1.

Таблица 1

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении метотрексата

Номер стандарта	Стандартный раствор метотрексата N 1,	Стандартный раствор метотрексата N 2,	0,1 н раствор, гидроксида натрия,	Концентрация метотрексата в градуировочном растворе,	Содержание метотрексата в градуировочном растворе, мкг
1	0,0	0,0	10,00	0,0	0,0
2	0,0	1,0	9,0	0,4	4,0
3	0,5	0,0	9,5	1,0	10,0
4	1,0	0,0	9,0	2,0	20,0
5	2,0	0,0	8,0	4,0	40,0
6	3,0	0,0	7,0	6,0	60,0
7	4,0	0,0	6,0	8,0	80,0

Градуировочные растворы используют свежеприготовленными.

Подготовленные градуировочные растворы перемешивают, и через 5 мин измеряют оптические плотности растворов в кювете с толщиной поглощающего слоя 20 мм при длине волны 303 нм по отношению к раствору сравнения, не содержащему определяемого вещества. Строят градуировочный график: на ось ординат наносят значения оптических плотностей градуировочных растворов, на ось абсцисс - соответствующие им содержания метотрексата (мкг).

Проверка градуировочного графика проводится 1 раз в квартал или в случае использования новой партии реактивов, оборудования и после ремонта прибора.

9.4. Отбор проб воздуха

Воздух с объёмным расходом 400  аспирируют через фильтр АФА-ВП-10, помещенный в фильтродержатель. Для определения 0,001  необходимо отобрать 4 000  воздуха. Пробы хранят в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 25°С не более суток.

10. Выполнение измерения

Фильтр с отобранной пробой переносят в химический бюкс с пришлифованной крышкой, вместимостью 25 , приливают 5  0,1 н водного раствора гидроксида натрия и оставляют на 5 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтр отжимают и повторно обрабатывают 5  того же раствора. Фильтр снова тщательно отжимают и удаляют. Оба раствора последовательно фильтруют на химической воронке через бумажный фильтр "белая лента" в пробирку вместимостью 10  и доводят 0,1 н водным раствором гидроксида натрия до 10 . Степень десорбции вещества с фильтра 98%.

Оптическую плотность получаемых анализируемых растворов измеряют в кювете с толщиной поглощающего слоя 20 мм при длине волны 303 нм по отношению к раствору сравнения, который готовят одновременно и аналогично пробам, используя чистый фильтр.

Количественное определение содержания метотрексата проводят по предварительно построенному градуировочному графику.

Примечание. Фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в 0,1 н водном растворе гидроксида натрия вспомогательных веществ, входящих в состав лиофилизированный лекарственной формы для инъекций.

11. Вычисление результатов измерений

Массовую концентрацию метотрексата (С, ) в воздухе рабочей зоны вычисляют по формуле:

, где

- количество метотрексата, найденное в анализируемом объеме раствора по градуировочному графику, мкг;

- объём воздуха, отобранного для анализа () и приведенного к стандартным условиям (прилож. 1).

12. Оформление результатов анализа

Результат количественного анализа представляют в виде: , , Р = 0,95. Значение  = 0,00072 + 0,19С, , где - характеристика погрешности.

13. Контроль погрешности методики КХА

Значения характеристики погрешности, норматива оперативного контроля погрешности и норматива оперативного контроля воспроизводимости приведены в табл. 2.

Таблица 2

Диапазон определяемых массовых концентраций метотрексата,	Наименование метрологической характеристики
	характеристика погрешности, , , Р = 0,95	норматив оперативного контроля погрешности, , , (Р = 0,90, m = 3)	норматив оперативного контроля воспроизводимости, D, , (P = 0,95, m = 2)
0,001 - 0,020	0,000072 + 0,19С	0,00010 + 0,17С	0,00028 + 0,29С

Метрологические характеристики приведены в виде зависимости от значения массовой концентрации анализируемого компонента в пробе - .

13.1. Оперативный контроль погрешности

Оперативный контроль погрешности выполняют в одной серии с КХА рабочих проб.

Образцами для контроля являются реальные пробы воздуха рабочей зоны. Объем отобранной для контроля пробы должен соответствовать удвоенному объему, необходимому для проведения анализа по методике. После отбора пробы экстракт с фильтра делят на две равные части, первую из которых анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы - . Вторую часть разбавляют соответствующим растворителем в два раза и снова делят на две равные части, первую из которых анализируют в точном соответствии с прописью методики, получая результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза - . Во вторую часть делают добавку анализируемого компонента () до массовой концентрации исходной рабочей пробы () - общая концентрация не должна превышать верхней границы диапазона измерения - и анализируют в точном соответствии с прописью методики, получая результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза, с добавкой - . Результаты анализа исходной рабочей пробы - , рабочей пробы, разбавленной в два раза, - и рабочей пробы, разбавленной в два раза, с добавкой - получают по возможности в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении условия:

, где

- результат анализа рабочей пробы;

- результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза;

- результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза, с добавкой анализируемого компонента;

- величина добавки анализируемого компонента;

- норматив оперативного контроля погрешности

K= 0,00010 + 0,17С ().

13.2. Оперативный контроль воспроизводимости

Образцами для контроля являются реальные пробы воздуха рабочей зоны. Объем отобранной для контроля пробы должен соответствовать удвоенному объему, необходимому для проведения анализа по методике. После отбора пробы экстракт с фильтра делят на две равные части и анализируют в точном соответствии с прописью методики, максимально варьируя условия проведения анализа, т.е. получают два результата анализа в разных лабораториях или в одной, используя при этом разные наборы мерной посуды, разные партии реактивов. Два результата анализа не должны отличаться друг от друга на величину допускаемых расхождений между результатами анализа:

, где

- результат анализа рабочей пробы;

- результат анализа этой же пробы, полученный в другой лаборатории или в этой же, но другим аналитиком с использованием другого набора мерной посуды и других партий реактивов;

- допустимые расхождения между результатами анализа одной и той же пробы

D = 0,00028 + 0,29C ().

При превышении норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива D выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

14. Нормы затрат времени на анализ

Для проведения серии анализов из 6 проб требуется 2 ч.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г. Г. Онищенко