Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42 "Полимеразная цепная реакция"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42
"Полимеразная цепная реакция"

Вводится впервые

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой многократное ферментно-опосредованное умножение (амплификацию) заданного участка ДНК длиной от десятков до нескольких тысяч пар оснований (п.о.), границы которого соответствуют коротким олигонуклеотидным последовательностям - праймерам, т.е. ПЦР представляет собой циклический синтез in vitro выбранного фрагмента ДНК. Каждый цикл состоит из трёх этапов: денатурации, гибридизации и синтеза цепи ДНК. При выявлении РНК-содержащих микроорганизмов ПЦР проводят после процедуры обратной транскрипции.

Специфичность реакции обеспечивается прежде всего правильным выбором праймеров.

После окончания реакции наличие искомого фрагмента выявляют различными методами, наиболее ракспространены электрофоретическое разделение и детекция флуоресценции в режиме реального времени.

ПЦР может использоваться как для качественной реакции (есть - нет), так и для полуколичественного и количественного определения.

Пробоподготовка

Определяемая ДНК может быть выделена из исследуемого образца либо вноситься в реакцию без предварительной подготовки.

В первом случае следует подтвердить, что процедура выделения не влияет на результаты ПЦР. С этой целью целесообразно провести аналогичную процедуру выделения с использованием стандартного образца ДНК.

Во втором случае, при внесении в реакцию тестируемого материала без проведения его предварительной подготовки, необходимо подтвердить отсутствие влияния на результаты ПЦР веществ, входящих в состав исследуемого образца. Для этого целесообразно использовать метод добавок.

Необходимо предусмотреть использование стандартных или контрольных образцов для оценки эффективности выделения нуклеиновых кислот.

Используемое оборудование, реагенты, приготовление растворов и все этапы должны быть указаны в частной фармакопейной статье.

Проведение реакции

ПЦР проводят в буферно-солевом растворе с определенным рН, содержащем необходимую концентрацию ионов магния, четыре вида дезоксирибонуклеозид-трифосфатов и термостабильную Taq-полимеразу (ДНК-полимераза микроорганизма Termus aquaticus обладает уникальным свойством сохранять активность при температуре 95°С). Состав буферного раствора, концентрацию реагентов, приготовление растворов указывают в частной фармакопейной статье. Реакция инициируется парой праймеров, каждый из которых представляет собой последовательность из 20-25 нуклеотидов, один праймер комплементарен последовательности ДНК с 5'-конца амплифицируемого участка, а другой - с 3'-конца (на противоположной цепочке ДНК). Последовательность праймеров, их концентрацию указывают в частной фармакопейной статье.

Целесообразно предусмотреть использование положительных и отрицательных стандартных и/или контрольных образцов для оценки эффективности амплификации.

ПЦР осуществляют в автоматическом режиме на специальных программируемых приборах - амплификаторах, контролирующих заданные параметры реакции: температуру и длительность отдельных этапов цикла (денатурация, гибридизация и синтез цепи ДНК), число циклов и т.д.

Денатурация. Выдерживание при температуре (94 - 96)°С в течение установленного времени; при этом двойная цепь денатурируется (расплетается) с образованием двух одноцепочечных молекул ДНК.

Гибридизация (отжиг). При температуре (45 - 65)°С в течение установленного времени происходит отжиг праймеров и одноцепочечной ДНК-матрицы, в процессе которого праймеры распознают комплементарные им участки ДНК-матрицы.

Синтез цепи ДНК (элонгация). При температуре (65 - 72)°С в течение установленного времени происходит репликация (достраивание) одной из одноцепочечных ДНК от точки связывания праймера "вправо" (для одной цепи ) и "влево" (для другой цепи ДНК). В результате вновь синтезируемые молекулы ДНК становятся, в свою очередь, матрицей для аналогичного синтеза новых копий.

Продолжительность цикла составляет 0,5 - 5 минут. Сразу после окончания первого цикла процедура повторяется и происходит экспоненциальное увеличение содержания фрагмента ДНК. Обычно ПЦР состоит из 25-40 циклов. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка ДНК, приводящее к увеличению в геометрической прогрессии общего содержания продуктов реакции.

Эффективность ПЦР и количество синтезированного при этом заданного фрагмента ДНК зависит от многих факторов, среди которых следует выделить: тип и термопроводящие характеристики амплификатора, тип используемой ДНК-полимеразы, состав буферного раствора, объем реакционной смеси; длину и состав праймеров; выбранную специфическую последовательность ДНК.

Используемое оборудование и режим амплификации указывают в частной фармакопейной статье.

Детекция продуктов амплификации

Электрофоретическое разделение. Продукты амплификации анализируют с помощью различных методов электофореза в агарозном или полиакриламидном гелях. Для визуализации ДНК используют окрашивание интеркалирующим красителем, обычно бромистым этидием (дающим характерное красноватое свечение при исследовании в проходящем ультрафиолетовом свете), нитратом серебра или используют мечение различными флуорохромами (дающими флюоресценцию определенной длины волны при возбуждении лазерным лучом). Для оценки размеров амплифицированных фрагментов используют маркеры и стандартные образцы.

Концентрацию геля, приготовление растворов, маркеры, стандартные образцы и условия электрофореза указывают в частной фармакопейной статье.

Детекция флуоресценции в режиме реального времени. Способ детекции амплифицированного фрагмента с использованием флуоресцентных меток возможен при проведении ПЦР в реальном времени (Real Time PCR).

Отличительной чертой данного метода, в сравнении с классической ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК в исследуемом материале, отсутствие стадии электрофореза и автоматическая регистрация детектируемого сигнала.

Метод основан на измерении флуоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации. Интенсивность сигнала пропорциональна концентрации продукта ПЦР, что в сочетании с возможностью оценить кинетику процесса, позволяет проводить количественное определение выбранной последовательности.

Для постановки ПЦР в реальном времени необходим амплификатор, обладающий способностью возбуждать и детектировать флуоресценцию на каждом цикле амплификации. Прибор состоит из трех блоков: амплификатора (термический блок), флуоресцентного детектора и компьютера с прилагаемым программным обеспечением.

Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют интеркалирующие красители (например, SybrGreen I) или специфические флуоресцентные зонды (например, система TaqMan). В первом варианте флуоресцентный краситель связывается с синтезируемой двухцепочечной ДНК с возникновением флуоресцентного свечения.

Во втором варианте используются ДНК-зонды, в состав которых введена флуоресцентная метка и гаситель флуоресценции. На стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и по достижении зонда расщепляет его благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к появлению детектируемого свечения.

Используемые реагенты, оборудование, условия ПЦР и программу расчета указывают в частной фармакопейной статье.

Оценка результатов

Полученные результаты учитывают, если одновременные испытания положительных и отрицательных стандартных или контрольных образцов получены положительные и отрицательные ответы соответственно.

При необходимости определения нуклеиновой кислоты, для которой установлено предельно допустимое содержание ДНК, следует проводить сравнение с результатом ПЦР стандартного образца с соответствующей концентрацией.

Для количественного определения специфической нуклеиновой кислоты следует использовать метод ПЦР в реальном времени и стандартный образец, аттестованный в установленном порядке.

Обеспечение качества

Оборудование должно быть аттестовано в установленном порядке.

Методика на основе ПЦР для неколичественного определения должна быть охарактеризована по специфичности и аналитической чувствительности. Аналитическую чувствительность определяют как минимальное количество целевых последовательностей (ДНК/РНК) в единице объема образца, которое может быть обнаружено в 100% образцов при 10-кратном проведении анализа или в 95% образцов при 24-кратном проведении анализа. Количество ДНК/РНК может быть выражено в международных единицах или числом копий.

Методика для количественного определения должна быть охарактеризована по специфичности, диапазону линейности, правильности и прецизионности.

Для установления указанных характеристик при возможности должны использоваться соответствующие международные стандартные образцы, а также отраслевые стандартные образцы или стандартные образцы предприятия, аттестованные в установленном порядке.

Стандартные и контрольные образцы.

Используемые стандартные образцы должны быть аттестованы в установленном порядке, контрольные образцы - охарактеризованы по необходимым показателям.

При каждой постановке ПЦР необходимо предусмотреть использование следующих образцов:

- положительный стандартный и/или контрольный образец, содержащие определенное количество целевой последовательности, предназначенные для проведения всех этапов ПЦР;

- положительный контрольный образец, содержащий определенное количество целевой последовательности, предназначенный для оценки этапа амплификации;

- отрицательный контрольный образец, являющийся свободным от целевых последовательностей для контроля отсутствия ложноположительных результатов;