Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС "Определение содержания антиальфастафилолизина (специфических антител) в сывороточных препаратах крови человека и животных"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС
"Определение содержания антиальфастафилолизина (специфических антител) в сывороточных препаратах крови человека и животных"

Вводится впервые

Для оценки специфической активности препаратов крови (донорская плазма, плазма для фракционирования, иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного и внутримышечного введения, иммуноглобулин человека антистафилококковый для внутримышечного введения);

- токсина стафилококкового диагностического,

- иммуногенности анатоксинов стафилококковых (раствора и суспензии), вводимых подкожно, определяют содержание антиальфастафилолизина - специфических антител к экзотоксину (синонимы: токсин стафилококковый, альфатоксин, альфастафилолизин) стафилококковому.

Метод определения основан на способности специфических антител нейтрализовать гемолитические свойства альфатоксина.

Используемые ингредиенты:

- натрия хлорида раствор 0,9%; (рН - );

- вода очищенная;

- отраслевой стандартный образец (ОСО) антиальфастафилолизина;

Отраслевой стандартный образец антиальфастафилолизина (ОСО 42-28-341 соответствующего года выпуска) представляет собой глицериновый раствор очищенной концентрированной сыворотки лошади, иммунизированной стафилококковым анатоксином, содержащей антитела к альфастафилолизину. Активность отраслевого стандартного образца устанавливается путем многократного сравнительного титрования с международным стандартным образцом и выражается в Международных единицах.

- эритроциты кролика.

Для того чтобы исключить искажение результатов испытания специфической активности препаратов, обязательно определяют уровень содержания антиальфастафилолизина в сыворотке крови кроликов - доноров. Пригодными считаются те кролики, в сыворотке которых антиальфастафилолизин отсутствует или содержится в количестве не более 0,125 МЕ/мл. Кролик в качестве донора может быть использован в течение 3 - 6 месяцев.

Кровь берут из сердца или краевой вены уха кролика - донора в стерильный сосуд со стеклянными бусами и дефибринируют её, встряхивая флакон круговыми движениями в течение 10 - 15 мин. Кровь освобождают от сгустка фибрина и бус, фильтруя её в стерильный флакон через марлю, сложенную в три слоя. Дефибринированная кровь пригодна для приготовления взвеси эритроцитов в течение 2 дней при условии хранения её при температуре от 4 до 8°С.

Кровь кролика можно консервировать, взяв её в равный объем модифицированного раствора Олсвера. (Для приготовления модифицированного раствора Олсвера делают навески: глюкозы - 24,6 г; натрия цитрата - 9,6 г; натрия хлорида - 5,04 г и растворяют их в 1200 мл очищенной воды. Доводят рН полученного раствора кислоты лимонной раствором 1 М до 6,1. Стерилизуют текучим паром в течение 30 минут).

Консервированная кровь пригодна для приготовления взвеси эритроцитов в течение 30 дней при условии хранения при температуре от 4 до 8°С.

В день проведения анализа эритроциты кролика из дефибринированной или консервированной крови отмывают трижды пятикратным объемом натрия хлорида раствором 0,9% в течение 15 мин при 1500 об/мин.

Из осадка отмытых эритроцитов готовят 15% взвесь, используя натрия хлорида раствор 0,9%. Для стандартизации методики устанавливают концентрацию эритроцитов в приготовленной взвеси, определяя коэффициент экстинкции гемолизированного раствора эритроцитов. Для этого к 0,5 мл приготовленной 15% взвеси эритроцитов кролика добавляют 2,0 мл воды очищенной, перемешивают круговыми движениями, после чего делают разведение полученного раствора 1:6.

Полученный в результате гемолиза раствор гемоглобина колориметрируют на КФК при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя 1 мм. Контролем служит вода очищенная. Показатель экстинкции приготовленного раствора должен быть равен .

В случае если показатель экстинкции выше 0,54, к рабочей 15% взвеси эритроцитов добавляют натрия хлорида раствор 0,9% в количестве, рассчитанном по формуле:

, где

- количество натрия хлорида раствора 0,9%, которое необходимо добавить;

- начальный объем 15% взвеси эритроцитов;

Е - оптическая плотность полученного гемолизированного раствора.

В случае если показатель экстинкции ниже, чем 0,52, то добавляют отмытые эритроциты в объеме, рассчитанном по формуле:

, где

- количество отмытых эритроцитов, которое необходимо добавить;

- количество отмытых эритроцитов, использованных для приготовления 15% взвеси;

Е - оптическая плотность полученного гемолизированного раствора.

После добавления или натрия хлорида раствора 0,9% или отмытых эритроцитов следует вновь определить показатель экстинкции приготовленного раствора. 15% взвесь эритроцитов с установленным коэффициентом экстинкции пригодна для проведения анализа в течение одного рабочего дня.

- набор реагентов для определения уровня антиальфастафилолизина в сывороточных препаратах крови человека и животных (токсин стафилококковый диагностический) ТУ 9383-001-01894956 соответствующего года выпуска.

Токсин стафилококковый диагностический представляет собой фильтрат бульонной культуры токсигенного штамма стафилококка 0-15 и выпускается с установленным значением Lh (лимит гемолитического действия токсина). Lh - это минимальное количество токсина стафилококкового, которое, будучи связанным с 1 МЕ (Международной единицей) ОСО антиальфастафилолизина, вызывает почти полный гемолиз взятых в опыт кроличьих эритроцитов (+++).

Исходя из величины Lh токсина, указанной в паспорте, готовят его разведения: в ряд пробирок, не касаясь стенок пробирок, вносят токсин в возрастающих количествах с интервалом в 0,01 мл, затем в каждую пробирку добавляют соответствующее количество натрия хлорида раствора 0,9%. до объема 1,0 мл.

ОСО антиальфастафилолизина разводят до содержания 1 МЕ антистафилолизина в 1,0 мл и добавляют по 1,0 мл в каждую пробирку разведений токсина. В контрольную пробирку наливают 2,0 мл натрия хлорида раствора 0,9%. Пробирки осторожно встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем в каждую пробирку (опытные и контрольную) добавляют по 0,1 мл 15% взвеси эритроцитов с установленным коэффициентом экстинкции. Пробирки снова осторожно встряхивают и инкубируют в термостате при °С в течение 1 ч.

Результаты учитывают визуально:

++++ - полный гемолиз эритроцитов;

+++ - почти полный гемолиз эритроцитов;

++ - частичный гемолиз (50% гемолиз эритроцитов);

+ - следы гемолиза эритроцитов;

- - отсутствие гемолиза эритроцитов.

В контрольной пробирке гемолиз эритроцитов должен отсутствовать. Количество токсина, содержащееся в первой пробирке, в которой произошел почти полный гемолиз эритроцитов, принимается за лимит его гемолитического действия в условиях опыта.

3. Стафилококковый токсин с установленной величиной Lh непосредственно перед проведением анализа разводят натрия хлорида раствором 0,9% до содержания Lh/5 в 1,0 мл. Количество исходного токсина и объем рабочего раствора стафилококкового токсина, необходимый для проведения анализа, рассчитывают, исходя из установленной величины Lh токсина и количества пробирок, необходимых для проведения анализа.

4. Используемая методика дает возможность определить содержание антиальфастафилолизина в испытуемых сывороточных препаратах в концентрациях от 0,2 МЕ в I мл и выше. Так как коммерческие препараты иммуноглобулинов человека, иммунные сыворотки и плазма содержат, как правило, в I мл более 0,2 МЕ антиальфастафилолизина, то для определения содержания антиальфастафилолизина в I мл препаратов готовят их разведения с учетом предполагаемого титра по схеме:

Схема разведения исследуемых препаратов

N пробирки	Предполагаемый титр антиальфа-стафилолизина, МЕ/мл	Разведение препарата	Количество вносимого в пробирку
			исследуемого препарата, мл	0,9% раствора натрия хлорида, мл
1	0,2	-	0,5	-
2	0,5	1:2,5	1,0	1,5
3	1	1:5	1,0	4,0
4	2	1:10	1,0	9,0
5	3	1:15	0,5 (из пробирки N 3)	1,0
6	4	1:20	0,5 (из пробирки N 3)	1,5
7	5	1:25	0,5 (из пробирки N 3)	2,0
8	6	1:30	0,5 (из пробирки N 3)	2,5
9	7	1:35	0,5 (из пробирки N 3)	3,0
10	8	1:40	0,5 (из пробирки N 3)	3,5
11	9	1:45	0,5 (из пробирки N 3)	4,0
12	10	1:50	0,5 (из пробирки N 3)	4,5
13	14	1:70	0,5 (из пробирки N 4)	3,0
14	16	1:80	0,5 (из пробирки N 4)	3,5
15	18	1:90	0,5 (из пробирки N 4)	4,0
16	20	1:100	0,5 (из пробирки N 4)	4,5
17	22	1:110	0,5 (из пробирки N 4)	5,0
18	24	1:120	0,5 (из пробирки N 4)	5,5
19	26	1:130	0,5 (из пробирки N 4)	6,0
20	28	1:140	0,5 (из пробирки N 4)	6,5
				и т.д.

5. Каждый опыт сопровождается контролем, необходимым для подтверждения соблюдения условий постановки опыта. Вследствие влияния различных факторов (нестабильность стафилококкового токсина в процессе хранения, технические погрешности при его разведении, возможные колебания чувствительности отдельных партий эритроцитов кролика к токсину и др.) результаты анализа могут отклониться в ту или другую сторону.

Контроль в опыте предусматривает оценку точности взятой в опыт дозы стафилококкового токсина и, при необходимости, коррекцию результатов опыта с помощью отраслевого стандартного образца (ОСО) антиальфастафилолизина,

ОСО антиальфастафилолизина в начале разводят натрия хлорида раствором 0,9% до содержания 1 МЕ в 1,0 мл. Далее из этого разведения, содержащего 1 МЕ/мл, готовят следующие разведения по схеме:

Схема разведения ОСО антиальфастафилолизина

N пробирки	Концентрация ОСО антиальфастафилолизина, МЕ/0,5 мл	Количество вносимого в пробирку
		ОСО антиальфа-стафилолизина в разведении 1 МЕ/мл, мл	раствора натрия хлорида 0,9%, мл
1	0,12	1,0	3,17
2	0,11	1,0	3,55
3	0,10	1,0	4,00
4	0,09	1,0	4,56
5	0,08	1,0	5,25

6. Проведение анализа.

В чистые пробирки переносят по 0,5 мл необходимых для анализа разведений препарата (опытный ряд) и по 0,5 мл приготовленных разведений ОСО антиальфастафилолизина (контрольный ряд), затем в каждую пробирку вносят по 0,5 мл рабочего разведения токсина стафилококкового. Пробирки осторожно встряхивают круговыми движениями и инкубируют при температуре 18 - 20°С в течение 15 мин.

Затем в каждую пробирку опытного и контрольного рядов добавляют по 1 капле (0,05 мл) свежеприготовленной 15% взвеси эритроцитов кролика с установленным коэффициентом экстинкции, вновь осторожно встряхивают круговыми движениями и инкубируют при температуре °С в течение 1 часа.

После инкубации проводят учет реакции по степени гемолиза.

7. Учет результатов начинают с визуальной оценки степени гемолиза. Отбирают в контрольном и опытном ряду - последнюю пробирку, в которой отмечается начало гемолиза (+), все пробирки с 50% гемолиза (++) и первую пробирку с гемолизом на (+++). Для остановки гемолиза отобранные пробирки помещают в холодильник на 10 минут при температуре от 4 до 8°С. После охлаждения пробирки центрифугируют в течение 5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость из каждой пробирки быстро и осторожно отбирают в чистые сухие пробирки и колориметрируют. Коэффициент экстинкции определяют при длине волны 400 нм, используя кюветы с толщиной слоя 1 мм. Раствором сравнения служит натрия хлорида раствор 0,9% . Коэффициент экстинкции, соответствующий 50% гемолизу, равен .

В начале коэффициент экстинкции определяют в пробирках контрольного ряда, содержащих разведения ОСО антиальфастафилолизина. При оптимальных условиях опыта 50% гемолиза эритроцитов с коэффициентом экстинкции регистрируется в пробирке, содержащей 0,1 МЕ ОСО антиальфастафилолизина, т.е. расчетная доза Lh/10 точно соответствует её истинному значению. В этом случае пробирка опытного ряда, в которой зарегистрирован гемолиз 50% эритроцитов, содержит 0,1 МЕ в объеме 0,5 мл, что соответствует содержанию 0,2 МЕ в мл. Для того чтобы рассчитать содержание антиальфастафилолизина в 1,0 мл неразведенного исследуемого препарата, необходимо умножить 0,2 МЕ на величину разведения в этой пробирке.

Например: первая пробирка, в которой зафиксирован показатель экстинкции , содержит препарат в разведении 1:100; следовательно, 1 мл неразведенного препарата содержит 0,2МЕ·100=20 МЕ.

Однако, как отмечалось выше, в результате влияния различных факторов, возможно несоответствие дозы токсина, используемой в опыте, расчетному значению. В таких случаях при расчете специфической активности испытуемых препаратов применяется коэффициент перерасчета, определяемый для каждого конкретного анализа по формуле:

, где

К - коэффициент перерасчета;

а - концентрация (количество МЕ) ОСО антиальфастафилолизина в первой пробирке контрольного ряда с показателем экстинкции .

8. Описанная выше методика не позволяет определить низкое содержание антиальфастафилолизина (менее 0,2 МЕ в 1 мл). Однако, чтобы исключить искажение результатов при определении специфической активности иммуноглобулинов и препаратов крови, необходимо определять содержание антиальфастафилолизина в сыворотке крови кроликов, используемых в качестве доноров для получения эритроцитов и приготовления 15% взвеси, а также при подборе кроликов для проведения испытания иммуногенности (специфической активности), специфической безвредности и антигенной активности стафилококковых анатоксинов. Многолетний опыт свидетельствует, что для таких целей пригодны кролики, в сыворотке крови которых антиальфастафилолизин отсутствует или содержится в количестве не более 0,125 МЕ в 1 мл.

Для определения малых концентраций антиальфастафилолизина можно использовать метод титрования препарата с использованием более высоких разведений токсина (Lh/20, Lh/40, Lh/80, и т.д.).

Определение содержания антиальфастафилолизина в сыворотке кроликов проводят следующим образом: испытуемые сыворотки разводят 0,85% раствором хлорида натрия, в 5 раз. Для этого в пробирку с 4 мл раствора хлорида натрия добавляется 1 мл сыворотки, соблюдая правила, изложенные в п. 1.3.4. Затем готовят в необходимых количествах два рабочих разведений стафилококкового токсина с содержанием 0,5 мл Lh/40, Lh/80. Для изготовления рабочих разведений токсина используют токсин с точно установленной величиной Lh=0,85% раствор хлорида натрия.

Разведенную в 5 раз испытуемую сыворотку разливают по 0,5 мл в 3 пробирки, затем в 2 из них добавляют по 0,5 мл рабочих разведений токсина, содержащих Lh/40 и Lh/80, а в третью пробирку, являющуюся контролем, вносят 0,5 мл хлорида натрия раствор 0,9%. Кроме того, для контроля литического действия токсина берут еще 2 - 3 пустые пробирки и наливают в них по 0,5 мл каждого разведения токсина и по 0,5 мл 0,85% раствора хлорида натрия. Пробирки осторожно встряхивают, оставляют при t° 18 - 22°С в течение 15 мин., затем добавляют мерной пипеткой по I капле (0,05 мл) рабочей взвеси эритроцитов кролика с коэффициентом экстинкции (приготовление рабочей взвеси эритроцитов см. п. 1.3.1). Пробирки вновь осторожно встряхивают и инкубируют при 37° C в течение I часа. Затем учитывают результаты визуально по схеме, изложенной в п.1.3.2. В контрольной пробирке без добавления токсина гемолиз эритроцитов должен отсутствовать; в контрольных пробирках с токсином, должен быть гемолиз эритроцитов.

Примеры оценки результатов опыта:

	Степень гемолиза в пробирках		Оценка результатов (количество МЕ в 1 мл сыворотки)
	Lh/40	Lh/80
Пример 1 Пример 2 Пример 3 Пример 4 Пример 5	++++ ++++ +++ ++ + (-)	+++ ++ + (-) - -	< 0,125 МЕ 0,125 МЕ > 0,125 < 0,25 МЕ 0,25 МЕ > 0,25 МЕ

Необходимо отметить, что получаемые таким методом результаты следует считать относительно точными, поскольку опыт не сопровождается контролем с национальным стандартом антиальфастафилолизина Необходимость включения в опыт контрольного, ряда в данном случае не оправдана, принимая во внимание цели определения антиальфастафилолизина. При необходимости точного определения малых концентраций антиальфастафилолизина следует использовать принципы, излагаемые в п. 1.3.4, но при постановке реакции - использовать более высокие разведения токсина.