Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42 "Определение подлинности и чистоты методом вестерн-блот"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42
"Определение подлинности и чистоты методом вестерн-блот"

Вводится впервые

Метод Вестерн-блот используют для оценки подлинности и чистоты иммунобиологических лекарственных средств на основе высокоочищенных белков, в том числе полученных по технологии рекомбинантной ДНК.

На первом этапе проводят электрофорез в полиакриламидном геле с SDS для разделения белков. Затем белки переносят на нитроцеллюлозную мембрану или PVDF-мембрану. Детекцию проводят с помощью специфичных к определяемому белку антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена, или последовательно с помощью первых антител к определяемому белку, и вторых антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена и специфичных к иммуноглобулину первых антител.

Испытание проводят в фармацевтических субстанциях или в готовой продукции.

Методика определения.

Электрофорез проводят в соответствии с методикой, изложенной в ОФС "Определение подлинности, чистоты и молекулярной массы генно-инженерных препаратов методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия".

При использовании геля с 10 лунками в лунку 1 вносят соответствующий 1-кратный буфер для приготовления образцов; в лунку 2 вносят 10 мкл смеси маркеров молекулярных масс (рекомендуется использование предварительно окрашенных маркеров молекулярных масс); в лунку 3 вносят пробу анализируемого белка: 40 мкг белка при оценке чистоты и 10 мкг - при оценке подлинности (количество вносимого белка может быть изменено на основании результатов валидации методики); в лунку 4 при оценке чистоты вносят количество анализируемого белка, соответствующее чувствительности методики; в лунку 5 вносят соответствующее количество стандартного образца белка (при его наличии); в лунки 6 - 10 геля вносят образцы, зеркально отражающие образцы в лунках 1-5. При необходимости нанесения большего числа образцов допускается использование двух гелей вместо разделения геля на две половины.

После окончания электрофореза гель разрезают вдоль между 5 и 6 лунками. Оценивают эффективность электрофореза: левую часть геля (лунки 1-5) окрашивают Кумасси ярко-голубым R-250 или G-250 в соответствии с методикой, изложенной в соответствующем разделе ОФС "Определение подлинности, чистоты и молекулярной массы генно-инженерных препаратов методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия" ОФС "Электрофорез". Маркеры молекулярных масс должны быть распределены равномерно по всей длине геля, при оценке чистоты должна быть видна белковая полоса в лунке 4.

Правую часть (лунки 6-10) используют для переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану для проведения иммуноблотинга.

Методика проведения иммуноблотинга

Для проведения иммуноблотинга используют прибор для переноса белков. Все работы проводят в резиновых перчатках.

Лист нитроцеллюлозной мембраны или PVDF-мембраны, соответствующий размеру геля помещают в кювету, заливают раствором для переноса белков, приготовление которого указывают в частной фармакопейной статье, и выдерживают в течение 10 мин.

Для переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану или PVDF-мембрану собирают "сендвич". Для этого специальную губку, входящую в комплект для переноса белков, смачивают в растворе для переноса белков и помещают на специальную пластиковую рамку. На нее помещают лист фильтровальной бумаги, предварительно смоченной в растворе для переноса белков. Сверху помещают гель, предварительно смоченный в растворе для переноса. На поверхность геля очень аккуратно (без пузырьков воздуха) помещают приготовленный лист нитроцеллюлозной мембраны или PVDF-мембраны. На нее помещают лист фильтровальной бумаги, предварительно смоченный в растворе для переноса белков, и сверху прикрывают второй специальной губкой, смоченной в растворе для переноса белков. Скрепляют рамку и медленно погружают в прибор для электрофореза, заполненный раствором для переноса белков, лист мембраны должен быть обращен к аноду. Включают прибор. Электрофоретический перенос осуществляется при температуре от 2 до 6°С и напряжении 100 В в течение 3 ч или при температуре от 2 до 6°С и напряжении 24 В в течение 17 ч (ночь).

Допускается использование оборудования для полусухого переноса белков с геля на мембрану в соответствии с инструкцией по его применению.

По окончании переноса "сендвич" разбирают, оставляя в контакте только сам гель и лист мембраны.

Нитроцеллюлозную мембрану после переноса (блот) аккуратно отделяют от геля и помещают в кювету с 50 мл раствора 1 и выдерживают 15 мин при температуре 37°С, сливают раствор, повторяют процедуру с новой порцией раствора.

Оценивают полноту переноса белков визуально по переносу предварительно окрашенных маркеров молекулярных масс или по результатам окрашивания геля Кумасси ярко-голубым R-250 или G-250 после переноса.

Время выдерживания блота в блокирующем и окрашивающем растворах и время отмывания блота, а также приготовление соответствующих растворов должны быть указаны в частной фармакопейной статье. Возможно применение растворов 1 - 6 (при использовании антител, конъюгированных с пероксидазой хрена) или 1-5 и 7 - при использовании антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой).

Реакцию останавливают, промывая блот деионизованной водой. С поверхности мембраны удаляют излишек воды фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе в темном месте.

Оценка результатов иммуноблотинга

На проявленной мембране основные окрашенные полосы должны соответствовать основным окрашенным белковым полосам на электрофореграмме. Содержание примеси, не выявляемой в блоте, не должно превышать величины, установленной в частной фармакопейной статье.

Критерии пригодности системы

Результаты иммуноблотинга могут учитываться, если:

- маркеры молекулярных масс распределены равномерно по всей длине соответствующей дорожки геля;

- на блоте видны все основные полосы, выявленные при окрашивании геля Кумасси ярко-голубым R-250 или G-250.

- выявляется образец с минимальной концентрацией, установленной в частной фармакопейной статье, при оценке чистоты должна быть видна белковая полоса в лунке 4.

Критерии приемлемости результатов

- совпадение блота исследуемого образца с блотом образца сравнения, например, соответствующего стандартного образца на основе очищенного белка (субстанции);

- соответствие молекулярной массы основного выявленного компонента требованиям спецификации;

- соответствие содержания выявляемой примеси в стандартном образце диапазону, установленному в свидетельстве на стандартный образец.

Методику определения подлинности и чистоты методом вестерн - блот следует использовать с подтвержденными валидационными характеристиками в отношении специфичности и предела обнаружения примеси.

Особенности валидация методики.

При использовании методики для оценки подлинности необходимо обосновать критерии приемлемости результатов, целесообразно использование стандартного образца на основе очищенного белка с научно обоснованной аттестуемой характеристикой, аттестованного в установленном порядке.

При использовании методики для оценки чистоты необходимо представить данные, обосновывающие предел обнаружения примеси. При количественном определении - представить данные, обосновывающие предел количественного определения примеси, линейный диапазон при определении основного компонента и примесей, воспроизводимость методики. Целесообразно использование стандартного образца на основе очищенного белка с научно обоснованной аттестуемой характеристикой.

При внесении изменений в методику, описанную в частной фармакопейной статье, должны быть подтверждены валидационные характеристики ранее утвержденной методики. Валидации подлежат следующие изменения:

- использование различного количества наносимых на гель проб;

- изменение условий переноса белков с геля на мембрану, включая изменение используемого оборудования.

Примечания.

Буферный раствор для переноса белков рН 8,3.

В градуированный химический стакан вместимостью 3000,0 мл помещают 7,86 г трис(гидроксиметил)аминометана, 33,75 г глицина, добавляют до 2400 мл деионизованной воды и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения, измеряют рН, который должен быть равен 8,3 - 8,4 (доводить рН раствора кислотой или щелочью не допускается). Добавляют 600,0 мл спирта этилового и перемешивают. Раствор для переноса можно использовать 2-3 раза. Раствор хранят в течение 6 мес при температуре от 4°С до 8°С.

10% раствор Твина-20.

В химический градуированный стакан помещают 10,0 г твина-20, прибавляют 80,0 мл воды деионизованной воды и перемешивают до полного растворения детергента. Затем переливают в мерную колбу и доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Раствор хранят в течение 3 мес при температуре от 4°С до 8°С.

Фосфатно-солевой буферный раствор рН 7,2 (ФСБ).

В градуированную емкость наливают 4500,0 мл деионизованной воды и поочередно прибавляют: 40,0 г натрия хлорида, 1,0 г калия хлорида 5,75 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 2-водного, 1,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного. Каждую следующую соль прибавляют после полного растворения предыдущей, доводят рН до 7,2 раствором 70% кислоты ортофосфорной или раствором 45% натрия гидроксида, доводят объем до 5000,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят в течение 3 мес при температуре от 4°С до 8°С.

Раствор 1. В мерную колбу вместимостью 1000,0 мл вносят 5,0 мл 10% раствора твин-20 и доводят до метки ФСБ. Раствор хранят в течение 1 мес при температуре от 4°С до 8°С.

Раствор 2. К 100,0 мл раствора 1 прибавляют 5,0 мг бычьего сывороточного альбумина и перемешивают до полного растворения. Раствор готовят перед применением.

Раствор 3. К 100,0 мл раствора 1 прибавляют 2,0 мг бычьего сывороточного альбумина и перемешивают до полного растворения. Раствор готовят перед использованием.

Раствор 4. Моноклональные или поликлональные антитела (первые анатитела) к анализируемому белку разводят в Растворе 3 или другом установленном растворе в соответствии с Инструкцией по их применению. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Раствор 5. Антитела поликлональные к IgG мыши, кролика или козы (в зависимости от вида животного, использовавшегося для получения первых антител), конъюгированные с щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена, разводят в Растворе 3 или другом установленном растворе в соответствии с Инструкцией по их применению. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Раствор 6. Раствор проявителя для проявления пероксидазы хрена

Используют TMB-субстрат, готовый к применению.

Раствор 7. Раствор для проявления щелочной фосфатазы

Растворяют 1 таблетку субстрата BCIP/NBT в 10 мл деионизованной воды. Раствор готовят непосредственно перед применением.