Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42 "Определение подлинности, чистоты и молекулярной массы генно-инженерных препаратов методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42
"Определение подлинности, чистоты и молекулярной массы генно-инженерных препаратов методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия"

Вводится взамен метода,
изложенного в ФС 42-3874-99

Метод используется для оценки генноинженерных продуктов, а также некоторых высокоочищенных биотехнологических препаратов, предназначенных для введения людям. Для определения чистоты, подлинности и молекулярной массы генноинженерных продуктов применяют метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (SDS) в редуцирующих и нередуцирующих условиях с последующей окраской геля Кумасси ярко голубым R-250 и/или нитратом серебра. Образование комплекса SDS с белком устраняет различия между белками, связанные с их зарядом, и переводит молекулы белков в конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы белка. При соблюдении этих условий подвижность белков отражает их кажущиеся молекулярные массы.

Испытанию подлежит полуфабрикат препарата (очищенный продукт) до добавления стабилизаторов, наполнителей, консервантов и других компонентов, входящих в состав лекарственной формы. Методика может использоваться для анализа готовой продукции с целью оценки подлинности в сравнении со стандартным образцом.

Электрофорез проводят в редуцирующих (в присутствии бета-меркаптоэтанола или дитиотрейтола) и нередуцирующих (в отсутствии бета-меркаптоэтанола или дитиотрейтола) условиях. При определении молекулярных масс генноинженерных белков анализ проводят с нагрузкой на лунку 10 мкг при окрашивании Кумасси ярко голубым R-250, и при нагрузке 2 мкг при окрашивании нитратом серебра. При определении чистоты анализ проводят с нагрузкой на лунку 40 мкг при окрашивании Кумасси ярко голубым R-250 и с нагрузкой 2 мкг при окрашивании нитратом серебра.

При отборе проб и растворов используют автоматические пипетки с соответствующими диапазонами объемов: от 1 мкл до 10 мкл; от 5 мкл до 40 мкл; от 40 мкл до 200 мкл; от 200 мкл до 1000 мкл; от 1 мл до 10 мл.

Методика определения. Полимеризацию геля проводят в ячейке, образованной стеклами и прокладками. Размер и толщина геля указывается в частных фармакопейных статьях. Сборку ячейки проводят в соответствии с инструкцией по работе с конкретным типом прибора для вертикального электрофореза. Описание метода проводится на примере аппарата со размерами стекол: внешнее стекло - 18 х 20 см, внутреннее стекло 16 х 20 см. Размеры прокладок: длина 18 см, ширина 18 мм, толщина 0,75-1,5 мм. При наличии приборов с другими характеристиками необходимо внести соответствующие коррективы в постановку испытаний.

Проведение электрофореза. Нижнюю камеру аппарата для электрофореза заполняют электродным буферным раствором и вставляют в нее электрофоретическую ячейку с гелем. Верхний резервуар заполняют электродным буферным раствором, удаляют из лунок пузырьки воздуха. Под слой буферного раствора в лунку вносят исследуемые образцы. Нанесение образцов на гель проводят в следующем порядке. В лунку 1 и 10 вносят соответствующий буфер для приготовления образцов, разбавленный деионизованной водой в четыре раза. В лунки 2 и 9 вносят по 7 мкл смеси стандартных белков. В остальные лунки вносят исследуемые образцы. При окрашивании Кумасси ярко голубым R-250 вносят попарно такие объемы образца, чтобы количество белка в них составляло соответственно 10 и 40 мкг. При оценке чистоты и окрашивании геля нитратом серебра в одну из лунок дополнительно вносят 0,002 мкг белка (для индикации выявления минимальных количеств белка в данных условиях). Электрофорез проводят при температуре 10-14°С в режиме постоянного тока. При прохождении фронта красителя через концентрирующий гель сила тока составляет 20-25 мА/гель. После вхождения фронта красителя в нижний разделяющий гель на 5-7 мм силу тока увеличивают до 35 мА/гель. После продвижения красителя на 14 см от нижнего края концентрирующего геля ток отключают, отделяют гель от стекол ячейки и переносят в кювету для окрашивания. Для того, чтобы можно было выявить присутствие в исследуемом образце агрегатов и других компонентов, не входящих в гель, концентрирующий гель полностью не обрезают.

Окрашивание геля. Окрашивание Кумасси ярко-голубым R-250. Гель помещают на 1 ч в фиксирующий раствор, сливают его и помещают на 16 ч в окрашивающий раствор. Затем окрашивающий раствор сливают, гель 2-3 раза споласкивают обесцвечивающим раствором. Обесцвечивание проводят в аппарате для обесцвечивания в течение 15 мин при напряжении 24 В. Гель вынимают из аппарата для обесцвечивания и ополаскивают раствором для обесцвечивания, затем деионизированной водой.

Окрашивание нитратом серебра. Окрашивание геля нитратом серебра проводят с использованием коммерческого набора реагентов согласно прилагаемой инструкции. Следует обратить внимание на время выдерживания геля в проявляющем растворе. Окрашивание прекращают в момент проявления полосы в лунке с минимальным количеством препарата (0,002 мкг).

Если необходимо, гель высушивают. В кювету наливают 0,5 л раствора для высушивания геля, помещают лист целлофановой диализной мембраны, например, фирмы "Фармация", Швеция. На него помещают гель и сверху накрывают вторым листом целлофановой диализной мембраны. Кювету закрывают крышкой и помещают на качалку. При покачивании гель выдерживают 20-30 мин. Стекло смачивают раствором для высушивания геля и на него плотно, без пузырьков воздуха натягивают смоченный лист целлофановой диализной мембраны, на нее помещают гель. Сверху плотно, без пузырьков воздуха, прикрывают вторым смоченным листом целлофановой диализной мембраны. Закрепляют на столе при комнатной температуре, не менее, чем на 18-20 часов. Высушенный гель снимают со стекла вместе с целлофановой диализной мембраной и аккуратно обрезают.

Денситометрия окрашенного геля. Денситометрию проводят с помощью лазерного денситометра в соответствии с инструкцией по эксплуатации данного прибора от верхнего края разделяющего геля по пути пробега белков в данной лунке. В зависимости от конструкции аппарата может проводиться денситометрия влажного и высушенного геля. Для учета фона геля может десинтометрироваться дорожка с нанесенным буферным раствором для образцов, разбавленным деионизированной водой в четыре раза (в нашем примере дорожки 1 и 10). На дорожках с буферным раствором не должны обнаруживаться окрашенные полосы.

Определение молекулярной массы. Для определения молекулярной массы выявленных белковых зон измеряют расстояние от верхнего края разделяющего геля до белковых зон анализируемого препарата и стандартных белков (R). Таким же образом определяют расстояние пробега красителя (величина Rо). Для каждого стандартного белка выявленной белковой зоны определяют коэффициент подвижности () по формуле:

,

где R - расстояние пробега белковых зон стандартных белков;

Rо - расстояние пробега красителя.

Строят график зависимости стандартного белка от логарифма его молекулярной массы. По для каждой белковой зоны исследуемого образца и по калибровочному графику определяют логарифмы молекулярной массы, из которых рассчитывают молекулярную массу соответствующих белков.

Оценка чистоты. Исследуемые образцы не должны содержать неидентифицированные продукты или их агрегаты в концентрирующем геле или на границе при вхождении в разделяющий гель. Содержание целевого белка, его олигомеров, фрагментов и примесей (в процентах) определяют по площади пиков при сканировании геля при помощи денситометра. Содержание целевого белка должно быть не менее 95%. Требования к другим параметрам (относительное содержание мономеров, олигомеров, фрагментов, белковых и небелковых примесей, чистота и картина дорожки на электрофореграмме в редуцирующих и нередуцирующих условиях при окрашивании Кумасси ярко-голубым R-250 и нитратом серебра определяется характеристиками и назначением конкретных исследуемых препаратов и указываются в частных фармакопейных статьях.

Примечания:

I. Приготовление разделяющего геля.

а) Для приготовления 15% геля в химический стакан емкостью 100 мл наливают 25 мл 30% раствора акриламида/бисакриамида, 12,5 мл буферного раствора трис-HCl концентрации 1,5 моль/л рН 8,8; 11,75 мл деионизированной воды и 500 мкл 10%-ного раствора SDS. Полученный раствор дегазируют 15 мин под вакуумом в колбе Бунзена. К дегазированному раствору прибавляют 250 мкл 10% раствора ПСА и 25 мкл ТЕМЕД, перемешивают и заливают в электрофоретическую ячейку.

б) Для приготовления 12% геля в химический стакан емкостью 100 мл наливают 20 мл 30% раствора акриламида/бисакриамида, 12,5 мл буферного раствора трис-HCl концентрации 1,5 моль/л рН 8,8; 16,75 мл деионизированной воды и 500 мкл 10% раствора SDS. Полученный раствор дегазируют 15 мин под вакуумом в колбе Бунзена. К дегазированному раствору добавляют 250 мкл 10% раствора ПСА и 25 мкл ТЕМЕД, перемешивают и заливают в электрофоретическую ячейку. Мениск раствора в ячейке должен находиться на расстоянии 3-4 см от верхнего края внутреннего стекла. На раствор в ячейке наслаивают 1,0 мл деионизованной воды так, чтобы гель и вода не перемешивались. Полимеризация геля происходит в течение 30-40 мин при температуре 18-25°С до появления четкой границы между гелем и водой.

II. Приготовление концентрирующего геля.

После окончания полимеризации нижнего разделяющего геля, воду сливают, поверхность геля тщательно подсушивают с помощью фильтровальной бумаги и заливают в ячейку 4% раствор верхнего концентрирующего геля. Для его приготовления в химический стакан емкостью 50 мл наливают 1,3 мл 30% раствора акриламида/бисакриамида, 2,5 мл раствора трис-HCl концентрации 0,5 моль/л рН 6,8; 6,1 мл деионизованной воды и 100 мкл 10% раствора SDS. Раствор дегазируют 15 мин под вакуумом в колбе Бунзена. К дегазированному раствору добавляют 50 мкл 10% раствора ПСА и 10 мкл ТЕМЕД, перемешивают и заливают в электрофоретическую ячейку. После этого в ячейку вставляют гребенку с необходимым (например, десятью) количеством лунок и толщиной, равной толщине прокладки. Полимеризация геля происходит в течение 30-40 мин при температуре 18-25°С. После завершения полимеризации гребенку удаляют и промывают образовавшиеся лунки один раз деионизированной водой и 3 раза электродным буферным раствором.

II. Приготовление растворов.

1 Электродный буферный раствор (5х) рН 8,3.

45,0 г трис(гидроксиметил)аминометана, 216,0 г глицина, 15,0 г SDS помещают в градуированный стакан, прибавляют 2000,0 мл деионизированной воды, перемешивают до полного растворения, доводят объем деионизованной воды до 3000,0 мл, фильтруют, измеряют рН, который должен быть равен 8,3. Доводить рН раствора кислотой или щелочью до необходимого значения не допускается.

2 Электродный буферный раствор рН 8,3.

К 600,0 мл электродного буферного раствора (5х) прибавляют 2400,0 мл деионизованной воды и перемешивают.

3 30% раствор акриамида/бисакриамида.

29,20 г акриамида и 0,80 г бисакриамида помещают в градуированный химический стакан и прибавляют 80,0 мл деионизированной воды, перемешивают до полного растворения, доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят в темной посуде при 4 - 6°С.

4. Буферный раствор трис-HCl концентрации 1,5 моль/л, рН 8,8.

54,450 г трис (гидроксиметил)аминометана помещают в градуированный химический стакан и прибавляют 150,0 мл деионизованной воды, перемешивают до полного растворения. Доводят рН до 8,8 раствором кислоты хлористоводородной концентрации 1 моль/л. Доводят объем до 300,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят при 4 - 6°С.

5. Буферный раствор трис-HCl концентрации 0,5 моль/л, рН 6,8.

6,0 г трис (гидроксиметил)аминометана помещают в градуированный химический стакан и прибавляют 60,0 мл деионизованной воды, перемешивают до полного растворения. Доводят рН до 6,8 раствором кислоты хлористоводородной концентрации 1 моль/л. Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят в течение месяца при 4 - 6°С.

6. 10%-ный раствор SDS.

10,0 г додецил сульфата натрия помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 80,0 мл деионизированной воды и тщательно перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Хранят при температуре 18 - 25°С.

7. 10% раствор ПСА.

100,0 мг аммония персульфата растворяют в 1,0 мл деионизованной воды. Используется только свежеприготовленный раствор.

8. 0,5% бромфеноловый синий.

0,25 г бромфенолового синего разводят в 50,0 мл деионизованной воды до полного растворения. Раствор хранят при температуре 18 - 25°С.

9. Раствор для приготовления образцов при проведении электрофореза в нередуцирующих условиях (4х).

В химический стакан помещают 4,2 мл деионизированной воды, 1,0 мл буферного раствора трис-HCl концентрации 0,5 моль/л рН 6,8, 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора SDS, 0,4 мл 0,5% раствора бромфенолового синего. Раствор тщательно перемешивают и хранят при температуре 18-25°С.

10. Раствор для приготовления образцов при проведении электрофореза в редуцирующих условиях (4х).

А) В химический стакан помещают 3,8 мл деионизированной воды, 1,0 мл буферного раствора трис-HCl концентрации 0,5 моль/л рН 6,8, 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора SDS; 0,4 мл beta-меркаптоэтанола; 0,4 мл 0,5% раствора бромфенолового синего. Раствор тщательно перемешивают и хранят при температуре 18 - 25°С.

Б) В химический стакан помещают 3,8 мл деионизированной воды, 1,0 мл буферного раствора трис-HCl концентрации 0,5 моль/л рН 6,8, 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора SDS; 0,48 г дитиотрейтола; 0,4 мл 0,5% раствора бромфенолового синего. Раствор тщательно перемешивают и хранят при температуре 18 - 25°С.

11. Образец исследуемого препарата смешивают в соотношении 3:1 с раствором для проведения электрофореза в нередуцирующих условиях или с раствором для проведения электрофореза в редуцирующих условиях. Смесь прогревают в кипящей водяной бане в течение 5 или 10 мин (в зависимости от исследуемого белка) и охлаждают до температуры 18 - 25°С.

12. Приготовление раствора стандартных белков для электрофореза.

Смесь стандартных белков для электрофореза, с соответствующим для данного исследования диапазоном молекулярных масс (например, от 14400 до 94000) растворяют в 100 мкл раствора для приготовления образцов (4х) для проведения электрофореза в редуцирующих условиях. Раствор прогревают в кипящей водяной бане в течение 5 мин и охлаждают до температуры 18 - 25°С. Разливают аликвоты (10, 15 или 20 мкл) и хранят при температуре не выше минус 20°С. Перед нанесением на гель аликвоты размораживают, разбавляют в соотношении 1:4 бидистиллированной водой и прогревают в кипящей водяной бане в течение 5 мин и охлаждают до температуры 18 - 25°С.

13. Фиксирующий раствор.

В химический стакан наливают 250,0 мл этилового спирта, 100,0 мл кислоты ледяной уксусной, добавляют деионизованной воды до объема 1000,0 мл. Хранят при температуре 18 - 25°С.

14. Окрашивающий раствор.

1,0 г Кумасси ярко-голубого R-250 помещают в химический стакан, доводят до объема 250,0 мл этиловым спиртом, перемешивают не менее 3,5 часов до полного растворения красителя, добавляют 100,0 мл кислоты ледяной уксусной и доводят объем деионизованной водой до 1000,0 мл. Хранят при температуре 18-25°С.

15. Обесцвечивающий раствор.

В химический стакан наливают 250,0 мл этилового спирта, 100,0 мл кислоты ледяной уксусной и доводят объем деионизованной водой до 1000,0 мл.

16. Раствор для высушивания геля.

В химический стакан наливают 150,0 мл этилового спирта, 50,0 мл глицерина, перемешивают и доводят объем деионизированной водой до 500,0 мл. Хранят при температуре 18-25°С.