Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42 "Определение специфической активности пробиотиков для медицинского применения"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42
"Определение специфической активности пробиотиков для медицинского применения"

Вводится впервые

Настоящая статья распространяется на методы определения специфической активности пробиотических производственных штаммов и пробиотиков для медицинского применения*.

Специфическая активность определяется количеством жизнеспособных бактерий в одной дозе лекарственного средства и активностью кислотообразования и/или антагонистической активностью по отношению к тест - штаммам.

Для определения специфической активности испытуемого препарата используют микробиологические методы, определяющие следующие показатели:

1. Определение количества жизнеспособных бактерий в одной дозе лекарственного средства (раздел 1);

2. Активность кислотообразования (раздел 2);

3. Антагонистическая активность (раздел 3).

Общая часть

Требования к специфической активности испытуемого препарата касаются определения количества живых бактерий в одной дозе лекарственного средства, кислотообразующей активности штаммов-продуцентов, входящих в лакто- и бифидосодержащие пробиотики для медицинского применения и определения уровня антагонистической активности испытуемого препарата.

Контроль испытуемого препарата по показателю "Определение количества живых бактерий в одной дозе лекарственного средства" является обязательным при отработке новых технологий производства лекарственного средства, при предварительном и сертификационном контроле, при оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности. Определение количества живых особей в дозе проводят методом серийных разведений, при необходимости, с последующим высевом на питательные среды. При проведении контроля поликомпонентных или комбинированных пробиотиков необходимо учитывать количество и соотношение всех видов или штаммов входящих в препарат.

Показатель "Активность кислотообразования" является обязательным при контроле штаммов-продуцентов, входящих в лакто- и бифидосодержащие пробиотики для медицинского применения.

Показатель "Антагонистическая активность" является обязательным при контроле колисодержащих и споровых пробиотиков для медицинского применения и производственных штаммов. Уровень антагонистической активности лекарственного средства в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов определяют методом отсроченного антагонизма на плотной среде по зонам задержки роста тест-штаммов.

Питательные среды используемые в испытаниях

Для выращивания микроорганизмов, входящих в пробиотики для медицинского применения используют адекватную для данного вида бактерий и для данной методики питательную среду (если нет других указаний в частной фармакопейной статье):

- для лактобактерий - МРС-2, МРС-4, МРС-5 и ацидофильных лактобактерий - стерильное обезжиренное молоко;

- для бифидобактерий - полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, среду Блаурокка с азидом натрия, МРС-5;

- для кишечной палочки - среда Эндо, МПА, среда Гаузе N 2 агаризованная;

- для энтерококков - МПА, среда N 1;

- для бактерии р. Bacillus - среда Гаузе N 2 агаризованная, МПА, полусинтетической среде с дрожжевым диализатом.

Среды для проведения испытаний могут быть приготовлены в соответствии с приведенными ниже указаниями. Также могут использоваться эквивалентные коммерчески доступные среды, при условии, что они выдерживают испытания на ростовые свойства. Необходимый рН питательных сред устанавливают при температуре °С.

Среда МРС-1

В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:

     Марганец сернокислый                                - 0,05 г

     Цистеин солянокислый или L-цистин                   - 0,10 г

     Магний сернокислый                                  - 0,200 г

     Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный         - 2,00 г

     Аммония цитрат                                      - 2,00 г

     Натрия ацетат. Натрий уксуснокислый                 - 5,00 г

     Печеночный экстракт (1:1) а)                        - 100,0 мл

     Дрожжевой аутолизат с содержанием

     аминного азота (0,15+-0,03)% б)                     - 50,0 мл

     Пептон сухой ферментативный                         - 10,00 г

     Гидролизат обезжиренного молока в)                  - 500,0 мл

     Полисорбат 80                                       - 1,00 мл

     Глюкоза                                             - 20,00 г

     Вода очищенная                                       до 1,00 л

рН

Разливают в пробирки по 10 мл, 25 мл или 30 мл и стерилизуют при температуре °С в течение мин (процесс стерилизации валидируется).

Срок хранения при температуре от 2 до 8°С питательной среды 2 мес или не более 1 мес при комнатной температуре.

Примечание:

а) Печеночный экстракт с содержанием аминного азота %:

     Печень говяжья                                      1,0 кг

     Вода (дистиллированная)                             1,00 л

Стерилизация в автоклаве при температуре в течение мин (процесс стерилизации валидируется).

Приготовление: 1,0 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3x3x3) см, заливают 1 л очищенной воды и кипятят в течение 1,5 - 2 ч, остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань "миткаль"), количество отвара доводят дистиллированной водой до 1 л и разливают в бутыли стерилизуют при температуре °С в течение мин. Срок хранения при температуре от 2 до 8°С не более 6 мес или не более 3 мес при комнатной температуре.

б) Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота %

     Дрожжи хлебопекарные                               1000 г

     Вода питьевая                                      4000 мл

     Хлороформ                                          40 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре в течение мин (процесс стерилизации валидируется).

в) Гидролизат обезжиренного молока по Богданову.

      Молоко коровье пастеризованное, нежирное рН (6,7+-0,1)    1,0 л

      Панкреатин                                                1,0 г

      Хлороформ                                                 5,0 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре в течение (процесс стерилизации валидируется).

     Среда МРС-2

     Марганец сернокислый                                  0,05 г

     Цистеин солянокислый или L-цистин                     0,10 г

     Магний сернокислый                                    0,20 г

     Калий фосфорнокислый двузамещенный

     3-водный                                              2,00 г

     Аммония цитрат                                        2,00 г

     Натрия ацетат                                         5,00 г

     Печеночный экстракт (1:1)                             100,0 мл

     Дрожжевой аутолизат с содержанием

     аминного азота (0,15+-0,03)%                          50,0 мл

     Пептон сухой ферментативный                           10,00 г

     Гидролизат обезжиренного молока                       500,0 мл

     Полисорбат 80 1,00 мл

     Глюкоза         20,00 г

     Агар микробиологический                               1,00 г

     Вода очищенная                                        до 1,00 л

     рН (6,4+-0,2)

Разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре °С в течение мин (процесс стерилизации валидируется).

Срок хранения при температуре от 2 до 8°С питательной среды 2 мес или не более 1 мес при комнатной температуре.

Среда МРС-4

В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:

     Марганец сернокислый                                  0,05 г

     Цистеин солянокислый или L-цистин                     0,10 г

     Магний сернокислый                                    0,200 г

     Калий фосфорнокислый двузамещенный

     3-водный                                              2,00 г

     Аммония цитрат                                        2,00 г

     Натрия ацетат                                         5,00 г

     Печеночный экстракт (1:1)                             100,0 мл

     Дрожжевой аутолизат с содержанием

     аминного азота (0,15+-0,03)%                          50,0 мл

     Пептон сухой ферментативный                           10,00 г

     Гидролизат обезжиренного молока                       500,0 мл

     Полисорбат 80                                         1,00 мл

     Глюкоза                                               20,00 г

     Агар микробиологический                               19,0 г

     Вода очищенная                                        до 1,00 л

     рН (6,4+-0,2)

Стерилизация в автоклаве при температуре °С в течение мин (процесс стерилизации валидируется).

Срок хранения питательной среды в течение 6 мес при температуре от 2 до 8°С в стерильных герметичных контейнерах (флаконы) или не более 3 мес при комнатной температуре.

Среда МРС-5

     Марганец сернокислый                                  0,05 г

     Цистеин солянокислый или L-цистин                     0,10 г

     Магний сернокислый                                    0,200 г

     Калий фосфорнокислый двузамещенный

     3-водный                                              2,0 г

     Печеночный экстракт (1:1)                             100,0 мл

     Дрожжевой аутолизат с содержанием

     аминного азота (0,15+-0,03)%                          50,0 мл

     Пептон сухой ферментативный                           10,0 г

     Гидролизат обезжиренного молока                       500,0 мл

     Полисорбат 80                                         1,00 мл

     Глюкоза                                               20,00 г

     Агар микробиологический                               15,0 г

     Вода очищенная                                        до 1,00 л

     рН 7,0

Стерилизация в автоклаве при температуре °С в течение мин (процесс стерилизации валидируется).

Срок хранения питательной среды в течение 6 мес при температуре от 2 до 8°С в стерильных герметичных контейнерах (флаконы) или не более 3 мес при комнатной температуре.

Обезжиренное стерильное молоко

     Молоко сухое обезжиренное                             - 80 г

     Вода очищенная                                        - до 1000 мл

     рН (6,7+-0,3)

Показатель кислотности не более 18 °Т

Разливают в пробирки по 10 мл, 25 мл или 30 мл и стерилизуют при температуре °С в течение мин (процесс стерилизации валидируется).

Срок хранения при температуре от 2 до 8°С питательной среды 2 мес или не более 1 мес при комнатной температуре

Модифицированная печеночная среда Блаурокка

Печеночный отвар (1:2)

     содержание аминного азота (100+-20) мг%               - 1 л

     Пептон сухой                                          - 10 г

     Натрия хлорид                                         - 5 г

     Лактоза                                               - 10 г

     Цистеин                                               - 0,1 г

     агар микробиологический                               - 1,2 г

     рН (7,2+-0,2)

Коррекцию рН проводят 20% раствором натрия гидроксида.

Разливают в пробирки по 10 мл, 25 мл или 30 мл и стерилизуют при температуре °С в течение мин (процесс стерилизации валидируется).

Срок хранения при температуре от 2 до 8°С питательной среды 2 мес или не более 1 мес при комнатной температуре (перед использованием, после 14 сут хранения, для снижения содержания растворенного кислорода среду следует однократно регенерировать путем нагревания пробирок на водяной бане, при температуре 70 - 80 °С в течение 10-15 мин).

а) Печеночный отвар с содержанием аминного азота  мг%

     Печень говяжья                                      0,5 кг

     Вода дистиллированная (очищенная)                   1,00 л

Стерилизация в автоклаве при температуре в течение мин (процесс стерилизации валидируется).

Приготовление: 0,5 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3х3х3) см, заливают 1 л очищенной воды и кипятят в течение 1,5 - 2 ч, остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань "миткаль"), количество отвара доводят дистиллированной водой до 1 л и разливают в бутыли стерилизуют при температуре °С в течение мин. Срок хранения при температуре от 2 до 8°С не более 6 мес или не более 3 мес при комнатной температуре.

Среда Блаурокка с азидом натрия

     Среда Блаурокка                                     - 1 л

     Натрия азид                                         - 0,1 г

Среду перемешивают, разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре °С в течение мин (процесс стерилизации валидируется).

Срок хранения при температуре от 2 до 8°С питательной среды 1 мес.

Среда Гаузе N 2 агаризованная

Бульон Хоттингера * с содержанием

     аминного азота 700 мг%                              - 30 мл

     Пептон сухой                                        - 5 г

     Натрия хлорид                                       - 5 г

     Глюкоза                                             - 10 г

     Агар микробиологический                             - 30 г

     Вода очищенная                                      - до 1000 мл

Примечание:

* Бульон Хоттингера:

     Гидролизах Хоттингера                                - 24,0 г

     Натрия хлорид                                        - 5,0 г

     Вода очищенная                                       - до 1000 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре °С в течение мин (процесс стерилизации валидируется).

Срок хранения питательной среды в течение 6 мес при температуре от 2 до 8°С в стерильных герметичных контейнерах (флаконы).

Полусинтетическая среда с дрожжевым диализатом агаризованная:

     Марганец хлористый 4-водный

     или марганец сернокислый                             - 0,01 г

     Железо (III) сернокислое 7-водное                    -0,01 г

     Магний сернокислый 7 водный или

     Магний хлорид 6-водный                               - 0,1 г

     Кальций хлорид                                       - 0.08 г

     Пептон сухой                                         - 0,5 г

     Дрожжевой диализат с содержанием

     аминного азота 150 мг%                                 5,0 мл

     Глюкоза                                                10,0 г

     Агар микробиологический                                20-30 г

     Вода очищенная                                         до 1 л

Стерилизация в автоклаве при температуре °С в течение мин (процесс стерилизации валидируется).

Срок хранения питательной среды в течение 6 мес при температуре от 2 до 8°С в стерильных герметичных контейнерах (флаконы).

Мясо-пептонный агар (МПА)

     Пептон                                               10,0 г

     Натрия хлорид                                        5,0 г

     Агар микробиологический                              13-20 г

     Мясная вода                                          300-500 мл.

     pH 7,3+-0,2.

Приготовление: В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г хлорида натрия, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают pH 7,2 - 7,4 и добавляют измельченный агар в количестве, зависящем от его качества и назначения среды. После добавления агара среду кипятят на слабом огне при постоянном перемешивании до полного растворения агара.

Разливают в пробирки и флаконы стерилизуют при температуре 120°С в течение мин (процесс стерилизации валидируется). После стерилизации среда, остывая, уплотняется.

Срок хранения при температуре от 2 до 8°С питательной среды 6 мес или не более 1 мес при комнатной температуре.

Мясо-пептонный бульон (МПБ)

     Пептон                                             10,0 г

     Натрия хлорид                                      5,0 г

     Мясная вода                                        1000 мл.

     pH 7,2 - 7,4.

Приготовление: см.МПА

Разливают в пробирки и флаконы стерилизуют при температуре 120°С в течение мин (процесс стерилизации валидируется). После стерилизации среда, остывая, уплотняется.

Срок хранения при температуре от 2 до 8°С питательной среды 6 мес или не более 1 мес при комнатной температуре.

Перед испытанием, по 10-15 или 20-25 мл расплавленной агаризованной питательной среды (при температуре около 45°С) разливают в стерильные чашки Петри диаметром 9 или 12 см (соответственно), оставляют на горизонтальной поверхности и дают среде застыть. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушить для удаления конденсационной воды и проверки стерильности. Чашки Петри с питательными средами помещают закрытыми и перевернутыми вверх дном в термостат при температуре °С на 48 ч. Агар Эндо подсушивают 40 мин в ламинарном шкафу с открытыми крышками.

Раздел 1. Определение количества жизнеспособных бактерий в одной дозе лекарственного средства

В настоящем разделе изложены общие принципы определения количества живых бактерий в пробиотиках для медицинского применения методом десятикратных разведений с высевом на плотные питательные среды (метод Коха) и глубинного чашечного метода или в жидкие и полужидкие среды (метод предельных разведений). Результаты количественного определения микроорганизмов выражаются в колониеобразующих единицах (КОЕ).

Для выращивания микроорганизмов, входящих в пробиотики для медицинского применения используют адекватную для данного вида бактерий и для данной методики питательную среду (если нет других указаний в частной фармакопейной статье):

- для лактобактерий - МРС-2, МРС-4, МРС-5 и ацидофильных лактобактерий - стерильное обезжиренное молоко;

- для бифидобактерий - полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, Среда блаурокка с азидом натрия, МРС-5;

- для кишечной палочки - среда Эндо, МПА, среда Гаузе N 2 агаризованная;

- для энтерококков - МПА, среда N 1;

- для бактерии р. Bacillus - среда Гаузе N 2 агаризованная, МПА, полусинтетической среде с дрожжевым диализатом.

Отбор и подготовка образцов для анализа

От каждой испытуемой серии лекарственного средства, методом случайной выборки отбирают по 3 образца (содержащего не менее трех доз).

Испытания проводят, соблюдая правила асептики.

Каждый образец в отдельности разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида и перемешивают пипеткой 8-10 раз.

Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в частной фармакопейной статье):

1. Лиофилизаты (флаконы) каждый образец в отдельности, ресуспензируют стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на одну дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз, получая исходное разведение.

2. Порошки - содержимое пакета (саше) асептично пересыпают в стерильную колбу вместимостью 250 мл, добавляют 100 мл 0,9% раствора натрия хлорида и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин, получая разведение .

3. Таблетки - каждый образец в отдельности, предварительно растирают в ступке до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на одну дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз, получая исходное разведение. Если таблетка содержит 1 дозу, то добавляют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида до общего объема 10 мл в зависимости от величины средней массы таблетки испытуемой серии (при массе 1 г добавляют 9,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида, а при массе 0,25 г - 9,75 мл 0,9% раствора натрия хлорида), получая разведение .

4. Капсулы - каждый образец в отдельности, вносят в пробирки, добавляют 10 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Пробирки с капсулами помещают на водяную баню при температуре °С. Через 10-30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение .

5. Суппозитории - каждый образец в отдельности, помещают в пробирки и добавляют предварительно нагретый до °С стерильный 0,9% раствор натрия хлорида до общего объема 10 мл в зависимости от величины средней массы суппозитория испытуемой серии (при массе 1,1 г добавляют 8,9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, а при массе 2 г - 8 мл 0,9% раствора натрия хлорида). Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре °С. Через 10-30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение .

Методика

Испытания проводят, соблюдая правила асептики. Из полученной микробной суспензии испытуемого образца в пробирках, содержащих по 9 мл 0,9% раствор натрия хлорида, готовят ряд последовательных десятикратных разведений. Для этого суспензию (исходного, или разведения) 10-15 раз перемешивают пипеткой и 1 мл бактериальной суспензии переносят в пробирку, содержащую 9 мл 0,9% раствор натрия хлорида, получая следующее разведение ( или ). Новой пипеткой содержимое пробирки перемешивают 8-10 раз и 1 мл суспензии переносят в следующее разведение. Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку.

В зависимости от биологических свойств бактерий, входящих в состав испытуемого образца, используют соответствующую методику испытания.

1. Высев на плотные питательные среды

1.1 (метод Коха)

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из двух последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в дозе исследуемого препарата) по 0,1 мл микробной суспензии высевают на чашки Петри с питательной средой (по две чашки на каждое разведение). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского или стеклянных бус, до полного впитывания (высыхания) суспензии, чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации.

Посевы инкубируют при температуре °С в течение 24-96 ч в адекватных, в зависимости от вида микроорганизма, условиях (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных). При инкубировании в анаэробных или микроаэрофильных условиях чашки Петри с посевами помещают в анаэростат и создают необходимые условия среды (анаэробные, микроаэрофильные).

Данный метод может быть использован при определении количества живых бактерий каждого вида в поликомпонентных пробиотиках при наличии визуальных отличий по форме колоний бактерий, входящих в препарат.

1.2 Глубинный чашечный метод

В ряду последовательных десятикратных разведений препарата испытуемого образца из двух последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в исследуемом препарате) по 1,0 мл микробной суспензии стерильной пипеткой вместимостью 1,0 мл вносят чашки Петри диаметром 90 мм (по 2 чашки на каждое разведение). Добавляют 20-25 мл расплавленной и охлажденной до °С агаризованной питательной среды, закрывают и быстро перемешивают вращательно-поступательными движениями, не отрывая дна чашки от поверхности стола и не допуская попадания среды на крышку чашки. После застывания агара чашки Петри переворачивают вверх дном и инкубируют в адекватных условиях при температуре
°С в течение необходимого для данного микроорганизма времени.

Учет результатов

По окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в одной дозе испытуемого образца. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний.

Пример расчета содержания живых микробных клеток в одной дозе испытуемого образца:

- из разведения выросло 42 и 45 колоний; среднее арифметическое равно (41+44) : 2 = 42,5;

- из разведения выросло 410 и 450 колоний; среднее арифметическое равно (425+445) : 2 = 435;

- количество живых бактерий в одной дозе равно:

Умножение числа выросших колоний производят на степень разведения и на 10, в том случае если высев на чашку Петри сделан в объеме 0,1 мл.

2. Метод предельных разведений с последующим высевом на жидкие и полужидкие питательные среды

2.1 Пробирочный метод наиболее вероятных чисел (определение количества живых ацидофильных лактобактерий)

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из разведений в 0,9% растворе натрия хлорида (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии от каждого разведения в две пробирки с 9 мл стерильного обезжиренного молока. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению в молоке. Для контроля среды добавляют 4 незасеянные пробирки с молоком. Посевы и контрольные пробирки инкубируют при температуре °С в течение 3-4 суток.

По окончании инкубации определяют количество пробирок со свернувшимся молоком. Из сгустка с культурой готовят мазки и окрашивают по Граму. Если в мазках видны характерные бактерии и отсутствует посторонняя микрофлора, то данное разведение учитывают, как содержащее микроорганизмы данного вида. В случае сквашивания молока в контрольных пробирках или обнаружении посторонней микрофлоры в мазках, контроль проводят на новой партии среды.

При подсчете количества живых особей используют таблицу Мак-Креди (таблица 1). Сначала составляют числовую характеристику. Она состоит из трех цифр: на первое место (слева) ставят цифру, равную числу пробирок со свернувшимся молоком, взятых в том последнем разведении, где молоко свернулось во всех пробирках (например, две пробирки разведения ).

Следующие две цифры обозначают число пробирок со свернувшимся молоком в двух последующих разведениях (например, в одной пробирке разведения и в одной пробирке разведения ).

Числовая характеристика результата будет 211.

По таблице Мак-Креди находят вероятное число, соответствующее полученной цифровой характеристике (в нашем случае 13), умножают его на разведение, которому соответствует первая цифра числовой характеристики (в данном примере - . Тогда количество живых особей микроорганизмов в одной дозе составляет .

Таблица 1 - Таблица Мак - Креди, используемая при подсчете количества живых ацидофильных лактобактерий

Числовая характеристика	Наиболее вероятное число микробов при заражении двух параллельных пробирок
200	2,5
201	5,0
202	-
210	6,0
211	13,0
212	20,0
220	25,0
221	70,0

2.2 Пробирочный метод учета колоний в полужидкой среде

Из разведений препарата (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10-6 препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению 10-6 в питательной полужидкой среде.

Посевы инкубируют при температуре °С в зависимости от вида микроорганизма в течение 1-6 суток. По окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост типичных колоний для данного вида микроорганизмов.

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в полужидкой питательной среде должно наблюдаться 10-и кратное уменьшение количества колоний микроорганизмов.

Количество живых бактерий в дозе вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке.

3. Определение количества живых бактерий в поликомпонентных пробиотиках

3.1 Комбинированный метод (определение количества бифидо- и колибактерий)

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в 0,9% растворе натрия хлорида (с по ) для определения количества живых бактерий из соответствующих разведений проводят высевы на среду Блаурокка с азидом натрия (учет бифидобактерий) и на среду Эндо (учет колибактерий).

Для определения количества бифидобактерий по 1 мл микробной суспензии из разведений высевают в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды Блаурокка с азидом натрия (отмечая разведение, из которого сделан посев). При этом учитывают, что разведение препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению в среде Блаурокка с азидом натрия. Посевы в среде Блаурокка с азидом натрия инкубируют при температуре °С в течение 4 - 5 суток.

Для определения количества колибактерий из разведений испытуемого образца по 0,1 мл микробной суспензии высевают на чашки Петри со средой Эндо (по две чашки от каждого разведения). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды Эндо шпателем Дригальского, до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре °С в течение 18-24 ч.

Учет результатов посевов

В среде Блаурокка с азидом натрия по окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост колоний в виде "гвоздиков". Количество живых бактерий в дозе вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке.

На среде Эндо по окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в одной дозе препарата. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний. Пример для расчета аналогичен описанному в подразделе по "методу Коха".

Раздел 2. Активность кислотообразования

Кислотообразующую активность штаммов-продуцентов, входящих в лакто- и бифидосодержащие пробиотики для медицинского применения определяют по титруемой кислотности при культивировании бактерий в адекватной питательной среде. Испытание количественного определения кислотообразующей активности проводят методом кислотно-основного титрования.

Для выращивания бифидобактерий используют полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, для лактобактерий - МРС-1 или стерильное обезжиренное молоко, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Реактивы используемые в испытании

- титрованный 0,1 М раствор натрия гидроксида;

- индикатор фенолфталеин 1,0% .

Особенности отбора и подготовки образцов для анализа

От каждой испытуемой серии лекарственного средства, независимо от ее объема, методом случайной выборки отбирают по 2 образца (содержащего не менее трех доз). В случае если испытуемый образец (т.е. таблетка/капсула/суппозиторий) содержит одну дозу, то один образец объединяют три таблетки/капсулы/суппозитория. Испытания проводят, соблюдая правила асептики.

Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в частной фармакопейной статье):

1 Лиофилизаты и таблетки:

1.1. Лиофилизаты (флаконы) каждый образец в отдельности, разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на одну дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз.

1.2. Таблетки - каждый образец в отдельности, предварительно растирают в ступке до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на одну дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз.

По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре °С и инкубируют в течение 48 - 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).

2 Порошки:

2.1. Порошки - содержимое пакета (соше) асептично пересыпают в пробирку, вместимостью 50 мл, содержащую 25 мл питательной среды, и перемешивают. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре °С и инкубируют в течение 48 - 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).

3 Капсулы и суппозитории:

3.1. Капсулы - каждый образец в отдельности, вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре °С. Через 20-30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре °С и инкубируют в течение 48 - 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).

3.2. Суппозитории - каждый образец в отдельности, вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре °С. Через 20-30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре °С и инкубируют в течение 48 - 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).

Примечание: После окончания инкубации суспензию в пробирках освобождают от жировой основы двумя способами:

- сразу после окончания инкубирования, когда температура посевов °С пипеткой удаляют растопленный верхний слой жира;

- пробирки охлаждают при температуре от 2 до 8°С в течение мин, затем застывшую суппозиторную основу снимают пастеркой с загнутым концом или бактериологической петлей.

Методика

Уровень кислотообразования определяют в каждом из двух образцов.

После окончания инкубации содержимое пробирки перемешивают пипетками 8-10 раз. Каждую пробу в объеме 10 мл, вносят в отдельную коническую колбу или стакан вместимостью 100 мл.

Штаммы-продуценты, выращенные в стерильном обезжиренном молоке, образуют сгусток. Образовавшийся сгусток разбивают путем тщательного перемешивания (10-12 раз) пипеткой вместимостью 10 мл. После этого 10 мл микробной суспензии прибавляют в коническую колбу вместимостью 100 мл, содержащую 20 мл очищенной воды. Колбу интенсивно встряхивают для равномерного перемешивания содержимого, затем прибавляют 2-3 капли индикатора фенолфталеина 1,0%.

Полученную суспензию титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до появления стойкого слабо-розового окрашивания и достижения рН (контролируют потенциометрически), при этом учитывают количество 0,1 М раствора натрия гидроксида идущего на титрование.

Учет результатов

Кислотность выражают в градусах Тернера (°Т) и вычисляют по формуле:

, где

А - количество миллилитров 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование 10 мл исследуемой суспензии;

К - поправка к титру 0,1 М раствора натрия гидроксида.

°Т - условная величина, выраженная в градусах Тернера;

Пример расчета: на титрование 10 мл микробной суспензии пошло 10,6 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, где К=1,03, тогда:

Вычисляют средний показатель из двух параллельных проб от каждого образца (пробирки) и средний показатель из двух образцов (пробирок) при условии, если показатель активности кислотообразования каждого из них был не ниже регламентированного.

Раздел 3. Антагонистическая активность

Определение антагонистической активности штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения проводят с помощью метода отсроченного антагонизма.

Для определения антагонистической активности штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения используют питательную среду, адекватную для данного вида бактерий (если нет других указаний в частной ФС):

- для лактобактерий и бифидобактерий - МРС-5;

- для кишечной палочки и споровых пробиотиков - Гаузе N 2,

Работа с тест-штаммами микроорганизмов

Тест-штаммы микроорганизмов, необходимые для проведения испытания, получают из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ "НЦ ЭСМП" (если нет других указаний в частной фармакопейной статье).

Тест-штаммы микроорганизмов, используемые в испытании, приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Список тест-штаммов микроорганизмов, используемых в испытаниях

Тест - микроорганизм	Номер штамма
Staphylococcus aureus	ATCC 6538 (FDA 209Р)
Escherichia coli	157
Shigella flexneri	170, 337
Shigella sonnei	5063
Proteus mirabilis	H-237 или 56/10
Proteus vulgaris	177 или 401
Candida albicans	1031

Тест-штаммы микроорганизмов лиофилизаты (в ампулах) получают из официальных коллекций с сертификатом соответствия (паспортом на штамм).

Активация лиофилизированных тест-штаммов микроорганизмов

Ампулы вскрывают в асептических условиях в соответствие с инструкцией производителя.

Для восстановления жизнеспособности культуры необходимо не менее двух пересевов на адекватной питательной среде (соответствующей потребностям используемого микроорганизма) с инкубацией в стандартных условиях. Для получения изолированных колоний, второй пересев культуры тест-штамма проводят на адекватной плотной питательной среде при инкубации в стандартных условиях.

Стандартной температурой для инкубации посевов на питательных средах для бактерий является °С, для грибов - °С, если нет других указаний в частных фармакопейных статьях.

После окончания инкубации культуры, изучают морфологию выросших колоний, микроскопируют мазки, окрашенные по Граму, изучают биохимические свойства с использованием тест-систем, разрешенных к использованию. Тест-штамм микроорганизма должен обладать типичными морфологическими, тинкториальными, биохимическими свойствами в соответствие с представленными сертификатами коллекции.

Тест-штаммы микроорганизмов в лиофилизированном виде хранятся при температуре °С в течение 24 мес.

Допускается не более пяти пассажей от исходной культуры.

Приготовление тест-штаммов микроорганизмов для испытания

Для испытания используют 18-часовую культуру второго или третьего пассажа, которую инкубируют на адекватной плотной питательной среде в адекватных условиях. Выросшую культуру, с поверхности плотной питательной среды, смывают 0,9% раствором натрия хлорида. Смыв (суспензию) собирают в стерильную посуду (флакон, пробирку и т.д.). В полученной суспензии, используя стандартный образец мутности 10 ЕД ОСО 42-28-85 или международный стандарт мутности (The International Reference Preparation of Opacity of 10 International Units)**, определяют концентрацию микробных клеток в оптических единицах (ОЕ). Затем полученную суспензию бактерий разводят 0,9% раствором натрия хлорида в два раза получая до концентрацию - ОЕ/мл.

Отбор и подготовка образцов для анализа

Методом случайной выборки отбирают образцы от каждой серии препарата. Посевы проводятся в стерильных условиях.

Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в частной фармакопейной статье):

Пробиотические штаммы (лиофилизаты) восстанавливают до первоначально высушенного объема (но не менее микробных клеток/мл), добавляя в лиофилизат 0,9% раствор натрия

Лиофилизаты разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на одну дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз

Таблетки предварительно растирают в ступке до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на одну дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз.

Порошки - содержимое пакета высыпают в пробирку, содержащую 25 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин.

Капсулы. Содержимое капсулы вносят в пробирку, добавляют 1 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида и перемешивают до гомогенного состояния.

Суппозитории вносят в пробирку, добавляют предварительно нагретый до °С стерильный 0,9% раствор натрия хлорида до общего объема 10 мл. Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре °С. Через 10-30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния и освобождают от жировой основы.

Примечание: Суспензию в пробирках освобождают от жировой основы двумя способами:

- через 3-5 мин после перемешивания суспензии до гомогенного состояния, когда температура °С, затем пипеткой удаляют растопленный верхний слой жира;

- пробирки охлаждают при температуре от 2 до 8°С в течение мин, затем застывшую суппозиторную основу снимают пастеркой с загнутым концом или бактериологической петлей.

Методика

Полученную суспензию, испытуемого образца, перемешивают и высевают на 6 чашек Петри с питательной средой бактериологической петлей диаметром  мм по диаметру чашки Петри (по две петли от центра чашки).

После инкубирования в течение 48 - 96 ч в адекватных условиях в зависимости от вида микроорганизма (в аэробных, микроаэрофильных или анаэробных) при температуре °С к выросшей культуре подсевают культуры тест-штаммов (в соответствии с требованиями частных ФС).

Подсев тест-штаммов производят петлей диаметром  мм в направлении перпендикулярном зоне роста изучаемого микроорганизма, не касаясь его. Чашки Петри перевернутые вверх дном инкубируют при температуре °С в течение 18-20 ч (если нет других указаний в частной фармакопейной статье).

Контролем роста тест штаммов служит их параллельный посев на чашки с той же питательной средой без испытуемой культуры.

Учет результатов

Учитывают величину зоны отсутствия роста тест-штамма, выраженную в мм зон угнетения роста.

Чем больше величина угнетения роста тест-культур, тем выше антагонистическая активность испытуемого штамма.

Высоким уровнем антагонистической активности для штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения является (если нет других указаний в частной фармакопейной статье):

- для штаммов-продуцентов, входящих в лактосодержащие пробиотики зоны угнетения роста тест-штаммов - не менее 20 мм;

- для штаммов-продуцентов, входящих в коли-, бифидо- и споросодержащие пробиотики зоны угнетения роста тест-штаммов - не менее 15 мм.

______________________________

* Далее по тексту пробиотические производственные штаммы и пробиотики для медицинского применения будут называться "испытуемый препарат"

** Далее по тексту "стандартный образец мутности 10 ЕД"