Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья "Филграстим раствор концентрированный"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья
"Филграстим раствор концентрированный"

Вводится впервые

Аминокислотная последовательность

MTPLGPASSL    PQSFLLKCLE    QVRKIQGDGA    ALQEKLCATY

KLCHPEELVL    LGHSLGIPWA    PLSSCPSQAL    QLAGСLSQLH

SGLFLYQGLL    QALEGISPEL    GPTLDTLQLD    VADFATTIWQ

QMEELGMAPA    LQPTQGAMPA    FASAFQRRAG    GVLVASHLQS

FLEVSYRVLR HLAQP

Эмпирическая формула

Молекулярная масса 18 799 Да

Филграстим - раствор белка, который имеет первичную структуру гранулоцитарно - колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) с дополнительной аминокислотой - метионин на N - конце (r-met HU G-CSF). В отличие от природного аналога, данный белок не гликозилирован. Г-КСФ человека продуцируется и секретируется эндотелиальными клетками, моноцитами и другими клетками иммунной системы. Белок стимулирует дифференцировку и пролиферацию лейкоцитарных стволовых клеток в зрелые гранулоциты и их выход в кровь из костного мозга.

Филграстим в качестве активного вещества входит в состав инъекционных иммунобиологических лекарственных препаратов, предназначенных для снижения продолжительности, выраженности нейтропении и фебрильных осложнений у больных, получающих цитостатическую химиотерапию или миелоаблативную терапию с последующей трансплантацией костного мозга, по поводу онкологических заболеваний.

Производство

Филграстим продуцируется бактериальными клетками, в геном которых введен ген Г-КСФ человека, т.е. производство основано на использовании технологии рекомбинантной ДНК.

Перед выпуском каждую партию готового не расфасованного продукта (балк) тестируют по показателям, указанным ниже, если не сделаны исключения уполномоченным органом.

Примесь белков клеток-продуцентов: не более 0,1% на 1 мг белка в соответствии с требованиями ОФС "Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК", если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Примесь ДНК клеток-продуцентов и ДНК вектора: не более 10 нг на дозу в соответствии с требованиями ОФС "Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК", если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Испытания

Описание. Прозрачная, бесцветная жидкость, допускается слегка желтоватое окрашивание.

Подлинность.

А. Метод обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, биологический метод in vivo, биологический метод in vitro с использованием клеточной культуры - в соответствии с разделами "Белок" и "Специфическая активность".

Препарат должен выдерживать требования в тестах, указанных в соответствующих разделах.

В. Изофокусирование (раздел "Примеси с зарядом, отличающимся от филграстима"). Сопоставление электрофореграмм, полученных при оценке чистоты для выявления примесей, заряд которых отличается от филграстима.

Норма: основная полоса на электрофореграмме испытуемого раствора должна соответствовать положению основной полосы на электрофореграмме стандартного раствора (а).

С. Эксклюзионная хроматография (раздел "Примеси с молекулярной массой большей, чем молекулярная масса филграстима"). Сопоставление хроматограмм, полученных при оценке чистоты для выявления примесей с молекулярной массой большей, чем у филграстима.

Норма: основной пик на хроматограмме испытуемого раствора по времени удерживания должен соответствовать основному пику на хроматограмме стандартного раствора.

Д. Электрофорез в полиакриламидном геле (раздел "Примеси с молекулярной массой, отличающейся от филграстима"). Исследование электрофореграмм, полученных при электрофорезе как в восстанавливающих, так и невосстанавливающих условиях при оценке чистоты для выявления примесей, молекулярная масса которых отличается от молекулярной массы филграстима.

Норма: основная полоса на электрофореграмме испытуемого раствора (а) должна соответствовать положению основной полосы на электрофореграмме стандартного раствора (б).

Е. Пептидное картирование

Селективный гидролиз пептидных связей

Норма: хроматографический профиль испытуемого раствора должен соответствовать хроматографическому профилю стандартного раствора.

Испытание проводят методом жидкостной хроматографии в соответствии с ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография".

Методика определения

Хроматографическое разделение:

подвижная фаза:

- подвижная фаза А: 0,5 мл трифторуксусной кислоты растворяют в 950 мл воды, добавляют 50 мл ацетонитрила для хроматографии и перемешивают

- подвижная фаза В: 0,5 мл трифторуксусной кислоты растворяют в 50 мл воды, добавляют 950 мл ацетонитрила для хроматографии и перемешивают.

Время (мин)	Подвижная фаза А (% объем/объем)	Подвижная фаза В (% объем/объем)
0 - 8
8 - 25
25 - 40
40 - 45	10	90

Скорость потока: 0,2 мл/мин

Детектирование: спектрофотометрия при длине волны 215 нм

Вводимая проба: 10 мкл

Пригодность хроматографической системы: хроматограмма стандартного раствора должна соответствовать хроматограмме гидролизованного филграстима, поставляемой с филграстимом CRS.

Примечания

Испытуемый раствор. В полипропиленовую пробирку вносят 50 мкл 0,02 М фосфатного буферного раствора (рН 8,0) и добавляют испытуемый образец в объеме, соответствующем 25 мкг белка. Затем добавляют 25 мкл 0,1 мг/мл раствора глютамилэндопептидазы для пептидного картирования, доводят объем раствора до 1 мл водой очищенной, закрывают крышкой и инкубируют при температуре 37°С в течение 18 ч. Прибавляют 125 мкл 8 М раствора гуанидина гидрохлорида и перемешивают и добавляют 10 мкл 1 М раствора дитиотреитола 154,2 г/л и вновь перемешивают. Закрывают пробирку крышкой и помещают в кипящую воду на 1 мин, затем охлаждают до комнатной температуры.

Раствор используют свежеприготовленным.

Приготовление 8 М раствора гуанидина гидрохлорида. 76,4 г гуанидина гидрохлорида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 70 мл воды очищенной, перемешивают, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Раствор хранят при температуре 2-8°С в течение 6 месяцев.

Приготовление 1 М раствора дитиотреитола. 15,4 г дитиотреитола помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 70 мл воды очищенной, перемешивают, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Раствор хранят при температуре минус 20°С в течение 6 месяцев.

Стандартный раствор. Готовят одновременно и аналогично в тех же условиях, что и испытуемый раствор, используя стандартный образец филграстима CRS.

Колонка

- размеры: длина 0,10 м, диаметр 2,1 мм

- наполнитель: силикагель октадецилсилильный для хроматографии (5 мкм) с размером пор 20 нм

- температура: 60°С

Прозрачность. Раствор должен быть прозрачным. Испытания проводят визуально в соответствии с ОФС "Прозрачность и степень мутности жидкостей".

Цветность. Раствор должен быть бесцветным, допускается слегка желтоватое окрашивание не превышающее степень окраски эталона . Испытания проводят в соответствии с ОФС "Степень окраски жидкостей".

рН. От 3,8 до 4,2, если в частной фармакопейной статье нет других указаний. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность". Период наблюдения за животными составляет 7 суток. Тест-дозы препарата для введения животным указывают в частной фармакопейной статье.

Примеси с молекулярной массой большей, чем молекулярная масса филграстима.

Норма: сумма пиков со временем удерживания меньшим, чем у основного пика, не более 2%. Испытания проводят методом эксклюзионной хроматография в соответствии с ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография" раздел "Эксклюзионная хроматография", используют обычную процедуру.

Методика определения

Подвижная фаза: 7,9 г аммония гидрокарбоната растворяют в 1000 мл воды, рН доводят до 7,0 фосфорной кислотой, доводят объем до 2000 мл водой очищенной.

Скорость потока: 0,5 мл/мин

Детектирование: спектрофотометрия при длине волны 215 нм

Вводимая проба: 20 мкл

Относительное время удерживания по пику филграстима мономера (время удерживания - около 19 мин): агрегаты - около 0,60; филграстима олигомер 1 - около 0,75; филграстима олигомер 2 - около 0,80; филграстима димер - около 0,85.

Пригодность хроматографической системы: раствор для оценки разрешения:

- время удерживания: филграстима мономер - от 17 до 20 мин.

- разрешение: не менее 3 между пиками филграстима димера и филграстима мономера.

Рассчитывают процентное содержание димера, олигомеров и агрегатов.

Примечания

Раствор А. 4,1 г натрия ацетата помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, растворяют в 400 мл воды очищенной, доводят рН до 4,0 3% раствором уксусной кислоты, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Испытуемый раствор. Приготовление раствора испытуемого образца с концентрацией 0,4 мг/мл с использованием раствора А должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Стандартный раствор. Приготовление раствора филграстима CRS с концентрацией 0,4 мг/мл с использованием раствора А должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Пробу стандартного раствора перемешивают в течение 30 сек на шейкере "вортекс".

Колонка

- размеры: длина 0,3 м, диаметр 7,8 мм

- наполнитель: силикагель гидрофильный для хроматографии (5 мкм), используемый для фракционирования глобулярных белков в диапазоне относительных молекулярных масс от 10 000 до 500 000.

- температура: 30°С

Примеси с молекулярной массой, отличающейся от филграстима.

Норма: примеси с молекулярной массой выше или ниже по сравнению с филграстимом - на электрофореграмме испытуемого раствора (а) не должны выявляться полосы с более интенсивным окрашиванием, чем основная полоса испытуемого раствора (д) (2%).

Испытания проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в соответствии с ОФС "Электрофорез" (Разделы: Электрофорез в ПААГ в восстанавливающих условиях; Электрофорез в ПААГ в невосстанавливающих условиях).

Методика определения

Обработка пробы: кипячение в течение 5 мин.

Объем пробы: 20 мкл

Детектирование: окрашивание серебром

Пригодность системы:

- стандартный раствор (а): на электрофореграмме соответствующие маркеры молекулярной массы должны быть распределены не менее чем на 80% длины геля

- на электрофореграмме испытуемого раствора (е) должна наблюдаться полоса

- на электрофореграммах испытуемых растворов (а) - (е) должна наблюдаться градация интенсивности окрашивания.

Примечания

Размеры геля: толщина 1 мм

Разрешающий гель: 13% акриламида

Буферный раствор для приготовления образцов (невосстанавливающие условия). Смешивают равные объемы воды очищенной и буферного раствора для приготовления образцов (концентрированного) для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии натрия додецилсульфата (SDS-ПААГ).

Буферный раствор для приготовления образцов (восстанавливающие условия). Смешивают равные объемы воды очищенной и буферного раствора для приготовления образцов в восстанавливающих условиях (концентрированного) для электрофореза с SDS в ПААГ, содержащего 2-меркаптоэтанол в качестве восстанавливающего реагента.

Испытуемый раствор (а). Приготовление раствора испытуемого образца с концентрацией 100 мг/мл с использованием буферного раствора для приготовления образцов должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Испытуемый раствор (б). К 0,20 мл испытуемого раствора (а) прибавляют 0,20 мл буферного раствора для приготовления образцов и перемешивают.

Испытуемый раствор (с). Отбирают 0,20 мл испытуемого раствора (б) доводят объем раствора до 1 мл буферным раствором для приготовления образцов и перемешивают.

Испытуемый раствор (д) Отбирают 0,20 мл испытуемого раствора (с) доводят объем раствора до 1 мл буферным раствором для приготовления образцов и перемешивают.

Испытуемый раствор (е). К 0,20 мл испытуемого раствора (д) прибавляют 0,20 мл буферного раствора для приготовления образцов и перемешивают.

Стандартный раствор (а). Раствор соответствующих маркеров молекулярной массы, пригодный для калибровки полиакриламидных гелей в присутствии натрия додецилсульфата в диапазоне 14,4 - 94 кДа.

Стандартный раствор (б). Приготовление раствора филграстима CRS с концентрацией 100 мкг/мл с использованием буферного раствора для приготовления образцов должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Примеси с зарядом, отличающимся от филграстима

Норма: интенсивность полос всех примесей на электрофореграмме испытуемого раствора не должна превышать интенсивность основной полосы на электрофореграмме стандартного раствора (б) (10%).

Испытания проводят методом изоэлектрического фокусирования в соответствии с ОФС "Изофокусирование (определение подлинности и чистоты генно-инженерных препаратов методом изоэлектрофокусирования)"

Методика определения

Фокусирование:

- градиент рН: 4,5-8,0

- католит: 1 М раствор натрия гидроксида

- анолит: 0,04 М раствор глутаминовой кислоты в 0,0025% растворе (об/об) фосфорной кислоты

- Объем пробы: 20 мкл.

Детектирование: как описано в ОФС "Изофокусирование (определение подлинности и чистоты генно-инженерных препаратов методом изоэлектрофокусирования)"

Пригодность системы:

- на электрофореграмме стандартного раствора (с) соответствующие маркеры изоэлектрических точек должны быть распределены не менее чем на 80% длины геля

- на электрофореграмме стандартного раствора (а) рI основных полос должна быть в диапазоне 5,7 - 6,3.

Примечания

Испытуемый раствор. Приготовление раствора испытуемого образца с концентрацией 0,3 мг/мл с использованием воды очищенной должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Стандартный раствор (а). Приготовление раствора филграстима CRS с концентрацией 0,3 мг/мл с использованием воды очищенной должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Стандартный раствор (б). Приготовление раствора филграстима CRS с концентрацией 0,03 мг/мл с использованием воды очищенной должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Стандартный раствор (с). Используют калибровочный раствор для установления изоэлектрических точек (pI), в диапазоне pI 2,5-6,5, приготовленный в соответствии с инструкцией по применению.

Родственные белки.

Норма: - любая примесь: каждая примесь - не более 2%

- общее содержание примесей: не более 3,5%.

Испытания проводят методом жидкостной хроматографии в соответствии с ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография", используют обычную процедуру.

Методика определения

Подвижная фаза:

- подвижная фаза А: 1,0 мл трифторуксусной кислоты разводят до 900 мл водой, затем прибавляют 100 мл ацетонитрила.

- подвижная фаза В: 1 мл трифторуксусной кислоты разводят до 200 мл водой, затем прибавляют 800 мл ацетонитрила.

Время (мин)	Подвижная фаза А (% - объем/объем)	Подвижная фаза В (% - объем/объем)
0 - 35
35 - 50
50 - 60

Скорость потока: 0,6 мл/мин.

Детектирование: спектрофотометрия при длине волны 215 нм

Вводимая проба: 50 мкл

Относительное время удерживания по пику филграстима (время удерживания - около 28 мин): окисленная форма 1 - около 0,85; окисленная форма 2 - около 0,95, дезамидированные формы - около 1,1.

Пригодность хроматографической системы: стандартный раствор (б):

- разрешение: не менее 1,5 между пиками окисленной формы 1 и окисленной формы 2.

Примечание

Раствор А. 0,1М ацетатный буферный раствор рН 4,0, содержащий 0,1 мг/мл полисорбата 80 и 50 мг/мл сорбитола CRS. Приготовление раствора указывается в частной фармакопейной статье.

Испытуемый раствор. Приготовление раствора испытуемого образца с концентрацией 0,2 мг/мл с использованием раствора А должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Стандартный раствор (а). Приготовление раствора филграстима CRS с концентрацией 0,2 мг/мл с использованием раствора А должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Стандартный раствор (б). К 500 мкл стандартного раствора (а) добавляют 6,8 мкл 0,45% раствора водорода пероксида (об/об), перемешивают; инкубируют в течение 30 мин при температуре 25°С, затем добавляют 1,5 мг L-метионина и вновь перемешивают.

Колонка:

- размеры: длина 0,25 м, диаметр 4,6 мм

- наполнитель: силикагель бутилсилильный для хроматографии (5 мкм) с размером пор 30 нм

- температура: 60°С

Бактериальные эндотоксины. Норма: менее 2 ЭЕ в объеме, который содержит 1,0 мг белка. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Бактериальные эндотоксины". Метод определения указывают в частной фармакопейной статье.

Стерильность. Препарат должен быть стерильным. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Стерильность" методом прямого посева или мембранной фильтрации.

Количественное определение.

Белок. Норма: не менее 0,9 мг белка в 1 мл. Испытания проводят методом жидкостной хроматографии в соответствии с ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография", по методике, описанной в разделе "Родственные белки" со следующими изменениями.

Вводимая проба: испытуемый раствор и стандартный раствор (а).

Содержание филграстима рассчитывают с учетом заявленного содержания в филграстиме CRS.

Специфическая активность.

Норма: не менее string МЕ на 1 мг белка.

Специфическую активность испытуемого препарата определяют путем сопоставления активности разведений испытуемого препарата и разведений Международного Стандарта филграстима или стандартного препарата, калиброванного по Международному Стандарту в международных единицах.

Международная единица - это активность установленного количества соответствующего Международного стандарта. Эквивалентность Международного стандарта в международных единицах (МЕ) устанавливается Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ).

Количественное определение активности филграстима проводят с использованием биологического метода in vitro на культуре клеток, основанного на том, что живые клетки преобразуют соли тетразолия (МТТ) в окрашенные соединения формазана. Пригодными также являются альтернативные методы количественного определения уровня пролиферации клеток, например измерение концентрации внутриклеточной АТФ путем оценки биолюминесценции люциферазы. После соответствующей процедуры валидации они могут быть использованы для количественного определения активности. Условия анализа (такие как, концентрация клеток, время инкубации и кратность разведения) должны быть подобраны и указаны в частной фармакопейной статье.

Испытание проводят с использованием соответствующей линии клеток, чувствительной к филграстиму (клеточная линия М-NFS-60, АТСС No. CRL - 1838). Клетки инкубируют с различными концентрациями испытуемого препарата и стандартного препарата филграстима. Затем к клеткам добавляют раствор соли тетразолия, который преобразуется клеточными дегидрогеназами в окрашенный продукт - формазан. Количество выделившегося формазана или степень окрашивания определяют методом спектрофотометрии.

Методика определения

Во все лунки 96-луночного планшета для микротитрования вносят по 50 мкл среды для разведения. В контрольные лунки, которые будут оцениваться как "бланк" (фон), добавляют еще по 50 мкл среды. В соответствующие лунки вносят по 50 мкл каждого разведения испытуемого раствора в трех повторностях (испытуемый препарат и стандартный препарат в концентрации около 800 МЕ/мл, а также серия из 10 двукратных разведений для построения калибровочной кривой). Готовят суспензию клеток М-NFS-60, содержащую клеток/мл, непосредственно перед использованием к клеткам прибавляют 2-меркаптоэтанол (2-МЭ) до конечной концентрации 0,1 мМ. По 50 мкл приготовленной суспензии клеток вносят в соответствующие лунки планшета. В момент добавления в лунки следует поддерживать клетки в состоянии однородной суспензии.

Инкубируют планшет при температуре 36,0 - 38,0°С в течение 44-48 ч в - инкубаторе с влажной атмосферой и содержанием %. В каждую лунку вносят по 20 мкл стерильного раствора соли тетразолия с концентрацией 5,0 г/л и повторно инкубируют 4 ч. Оценивают количество образовавшегося формазана путем спектрофотометрии при длине волны 490 нм.

Для расчета активности препарата используют метод наименьших квадратов (ОФС "Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности препаратов биологическими методами").

Рассчитанная активность препарата должна составлять не менее 80% и не более 125% от заявленной активности препарата. Доверительные интервалы (Р = 0,95) должны быть не ниже 74% и не более 130% от заявленной активности препарата.

Специфическая гемостимулирующая активность препарата определяется на модели цитостатической миелосупрессии у лабораторных животных, вызываемой введением циклофосфамида. Через 24 ч после однократного внутрибрюшинного введения цитостатика животным (мыши линии СВА/CaLac или гибриды F1[CBAxC57Bl/6]) вводят препарат в течение 4 дней. На 5 день проводят взятие периферической крови для исследования количества лейкоцитов. Сопоставляют абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов у мышей, получавших циклофосфамид в разовой дозе 150 или 200 мг/кг (в зависимости от линии и пола мышей) и испытуемый препарат, с количеством анализируемых клеток у мышей на фоне введения одного циклофосфамида. Величина оцениваемого показателя должна составлять не менее 300%.

Упаковка и Маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".

Транспортирование и хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства". Не замораживать.