Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42- "Определение концентрации анатоксинов/ токсинов в реакции флокуляции"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42-
"Определение концентрации анатоксинов/ токсинов в реакции флокуляции"

Вводится впервые

Реакция флокуляции предназначена для количественного определения содержания анатоксинов или токсинов в растворе в единицах флокуляции (Lf).

Реакция флокуляции по Рамону (Ramon assay) основана на способности некоторых антигенов при соединении со специфическими антителами образовывать нерастворимый комплекс антиген-антитело, который визуально выявляется в виде помутнения среды и образования хлопьев (флокулята). Характерной особенностью реакции флокуляции является феномен инициальной флокуляции, т.е. способность формирования флокулята в первую очередь в тех растворах, где количества антигена и антитела (токсина/анатоксина-антитоксина) эквивалентны.

Для проведения испытания используют специфический антитоксин, калиброванный, в зависимости от использованного иммунохимического метода, в Международных единицах (МЕ) или Lf-эквивалентах (Lf-eq.). Предпочтительнее использовать антитоксины, калиброванные в Lf-eq. против соответствующих международных референс-препаратов анатоксинов для флокуляционных тестов.

За 1 Lf принимают количество анатоксина, которое вступает в реакцию флокуляции с 1 МЕ или Lf-eq. в наиболее короткий промежуток времени. Концентрацию токсина/анатоксина в растворе, определенную в реакции флокуляции, выражают в Lf/мл.

Проведение испытания

Специфический антитоксин в концентрации 100 МЕ или Lf -eq. в 1 мл вносят в возрастающих объемах (количествах МЕ) в ряд пробирок, содержащих равные объемы испытуемого раствора токсина/анатоксина. Содержимое каждой пробирки доводят до постоянного объема 0,9% раствором натрия хлорида. Смеси перемешивают, избегая образования пены. Пробирки со смесями инкубируют в водяной бане при температуре 45-50°С, периодически оценивая состояние растворов. Наблюдение проводят в проходящем свете, при необходимости применяют лупу. Отмечают пробирки, в которых раньше других произошла флокуляция, и время наступления флокуляции (Kf) . Первая пробирка, в которой наблюдается появления хлопьев (инициальная флокуляция), содержит эквивалентные или близкие к эквивалентным количества антигена и антитела. Для расчета содержания антигена учитывают количество антитоксина в этой пробирке. Если инициальная флокуляция наблюдается одновременно в двух пробирках, для расчета берут среднее значение величин антитоксина, содержащегося в этих пробирках. Концентрацию токсина/анатоксина в испытуемой смеси рассчитывают по количеству антитоксина в пробирке с инициальной флокуляцией с учетом степени разведения исходного испытуемого раствора.

Показатель (Кf) является полезным индикатором качества антигена. Если при данных значениях температуры и концентраций анатоксина и антитоксина значение Кf при повторных испытаниях увеличивается по сравнению с наблюдавшимся ранее, это свидетельствует о разрушении антигена и снижении его иммуногенной активности.

Пример

N пробирки	1	2	3	4	5
Объем раствора испытуемого анатоксина (мл)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Объем внесенного антитоксина (мл)	0,35	0,40	0,45	0,50	0,55
Количество МЕ внесенного антитоксина	35	40	45	50	55
Объем внесенного раствора 0,9% натрия хлорида (мл)	0,65	0,60	0,55	0,50	0,45

В данном примере, в случае если первая пробирка, в которой наблюдалась флокуляция, имела номер 3, в этой пробирке содержится анатоксин с концентрацией близкой или раной эквивалентной. В данном случае - 45 Lf/мл. Если исходный тестируемый раствор был разведен в 10 раз, концентрация анатоксина в испытуемом растворе равна (45x10) 450 Lf/мл. Если инициальная флокуляция произошла в пробирке N 1 или N 5, результаты не учитывают. Тест следует повторить, изменив количество вносимого антитоксина или разведение испытуемого раствора токсина/анатоксина. Для выполнения повторной реакции объемы вносимого в пробирки антитоксина следует выбирать с учетом того, чтобы крайняя пробирка (N 1 или N 5), в которой наблюдалась инициальная флокуляция, оказалась в середине ряда.

Для получения более точных результатов повторяют тест, выполняя реакцию флокуляции с объемами вносимого антитоксина, близкими по значению к эквивалентной концентрации, используя меньшие различия во вносимых объемах. Например: если инициальная флокуляция произошла в пробирке N 3, следует для уточнения эквивалентной концентрации повторить реакцию, внося в пробирки ряда антитоксин в объемах 0,41-0,43-0,45-0,47-0,49 мл.

Для подтверждения полученных результатов тест следует повторить. Результаты считаются приемлемыми, если в повторных тестах наблюдаются различия не более чем на одно разведение антитоксина.

Определение концентрации токсинов/анатоксинов с низкой концентрацией

Для анатоксинов с низкой концентрацией предпочтительнее использовать метод смешанной флокуляции, поскольку Lf смеси анатоксинов равен сумме их Lf, если они гомогенны. Метод заключается в сравнении значений Lf известного анатоксина и Lf этого же анатоксина в смеси с анатоксином низкой концентрации. Если токсины/анатоксины не гомогенны, может возникать ложная картина с двумя флокуляционными максимумами.

Например: анатоксин с известной концентрацией разводят 0,9% раствором натрия хлорида в соотношении 1:1. Тот же анатоксин смешивают с испытуемым анатоксином равных соотношениях. Каждую из смесей разливают по 1 мл в ряд пробирок. В пробирки обоих рядов вносят в возрастающих объемах антитоксин с концентрацией 100 МЕ/мл и 0,9% раствор натрия хлорида до доведения общего объема в каждой из пробирок до постоянной величины. Инкубируют пробирки в водяной бане при температуре 45-50°С , периодически оценивая состояние раствора. Отмечают пробирки с инициальной флокуляцией в каждом ряду. Разница в показателях инициальной флокуляции каждого ряда указывает на величину концентрации испытуемого анатоксина с низкой концентрацией.