Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья "Анатоксин стафилококковый очищенный, раствор для подкожного введения"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья
"Анатоксин стафилококковый очищенный, раствор для подкожного введения"

Вводится впервые

Анатоксин стафилококковый очищенный, раствор для подкожного введения, представляет собой токсин стафилококковый, обезвреженный и очищенный от балластных белков способом, гарантирующим полную детоксикацию и отсутствие возможности реверсии токсичности при сохранении антигенной активности.

Препарат не содержит консервантов и антибиотиков.

При подкожном введении анатоксин стафилококковый очищенный, вызывает образование специфических антител против экзотоксина стафилококкового.

Область применения - специфическая иммунотерапия острой и хронической (в стадии обострения) стафилококковой инфекции у взрослых.

Производство

При производстве анатоксина стафилококкового очищенного используют штамм Staphylococcus aureus О15, который получен и депонирован в официальной коллекции, происхождение и история которого документированы.

При культивировании на жидких питательных средах штамм должен образовывать токсин стафилококковый (синонимы: экзотоксин, альфатоксин, альфастафилолизин). Метод культивирования должен обеспечивать высокую продукцию токсина, сохранять гемолитические свойства штамма и исключать контаминацию штамма посторонней микрофлорой. Токсинсодержащая культуральная жидкость, освобожденная от микробных клеток и продуктов их распада, должна содержать токсин стафилококковый с гемолитической активностью не менее 500 DHM (минимальная гемолитическая доза) и иметь Lh (лимит гемолитического действия) токсина не более 0,4 мл. Способ детоксикации токсина стафилококкового обеспечивает и гарантирует отсутствие и возможность возврата токсичности при сохранении антигенной и специфической активности анатоксина стафилококкового.

Испытания

Описание. Определяют визуально. Прозрачная жидкость бесцветная или светло-желтого цвета.

Подлинность. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Определение содержания антиальфастафилолизина (специфических антител) в препаратах крови". Должен вызывать образование антител к токсину стафилококковому.

Прозрачность. Должен быть прозрачным. Определение проводят визуально.

Цветность. Не должен быть окрашен более эталона Y6. Определение проводят в соответствии с ОФС "Степень окраски жидкостей"

Извлекаемый объём. Нормативные требования указываются в частной фармакопейной статье. Определение проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения".

Механические включения. Видимые механические включения должны отсутствовать. Определение проводят в соответствии с ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

рН. От 6,2 до 7,4, если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Стерильность. Препарат должен быть стерильным. Определение проводят методом прямого посева в соответствии с ОФС "Стерильность".

Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным. Определение проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность".

Белым мышам (массой тела 18 - 20 г) препарат вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл, морским свинкам - подкожно по 2 мл. Препарат считают выдержавшим испытание, если:

- в течение 7 суток наблюдения все животные остались живы и ни у одного из животных не были выявлены видимые признаки заболевания;

- ни у одного из животных не отмечена потеря массы тела;

- ни у одной морской свинки в месте введения препарата не развился абсцесс или некроз.

Если в течение периода наблюдения, хотя бы у одного животного, регистрируют гибель, заболевание, уменьшение массы или повреждение в месте инъекции, испытание повторяют на удвоенном количестве животных при тех же условиях учета опыта. Повторное испытание считают удовлетворительным, если препарат отвечает вышеперечисленным требованиям.

Специфическая безвредность. Препарат должен быть безвредным.

Двум кроликам массой тела 2,0 - 2,5 кг вводят по 3,0 мл препарата подкожно в боковую поверхность тела и в той же дозе - внутривенно. Препарат считают выдержавшим испытание, если в течение 5 суток наблюдения кролики остаются здоровыми и в местах введения препарата отсутствуют явления некроза тканей.

Примечание: Для проведения исследования специфической безвредности и специфической активности (иммуногенности) используют кроликов, содержащих в 1 мл сыворотки крови не более 0,125 МЕ (Международных единиц) антиальфастафилолизина. Определение проводят по ОФС "Определение содержания антиальфастафилолизина (специфических антител) в сывороточных препаратах крови человека и животных".

Специфическая активность (иммуногенность). Значение содержания антиальфастафилолизина (специфических антител) в сыворотке крови трех кроликов, иммунизированных препаратом, должно быть не менее 3 МЕ в 1 мл.

Трем кроликам массой тела  кг, признанным пригодными для проведения испытания, препарат вводят подкожно в боковую поверхность тела трехкратно с интервалом 5 - 6 суток в объемах: 0,5; 1,0; 1,0 мл. Через 7 - 9 суток после последней иммунизации у кроликов берут кровь из краевой вены уха и определяют в сыворотке крови каждого животного содержание антиальфастафилолизина.

Испытание проводят по ОФС "Определение содержания антиальфастафилолизина (специфических антител) в сывороточных препаратах крови человека и животных".

Антигенная активность (антитоксинсвязывающая способность).

1,0 мл препарата должен содержать от 10 до 14 ЕС (единиц связывания) стафилококкового анатоксина. 1 ЕС представляет собой минимальное количество анатоксина, которое связывает 1 МЕ (Международную единицу) антиальфастафилолизина.

Метод определения антигенной активности основан на способности стафилококкового анатоксина связывать специфические антитела (антиальфастафилолизин) и на способности антител нейтрализовать гемолитические свойства токсина стафилококкового.

Для постановки реакции используют следующие ингредиенты:

- испытуемый анатоксин стафилококковый;

- НТП ОСО содержания антиальфастафилолизина соответствующего года выпуска, с установленным содержанием стафилококковых антител;

- токсин стафилококковый, гемолитические свойства которого характеризуются величиной Lh (лимит гемолитического действия - минимальное количество токсина стафилококкового, которое, будучи связано с 1 МЕ антиальфастафилолизина, вызывает почти полный (3+) гемолиз эритроцитов кролика);

- 15% взвесь эритроцитов кролика;

- 0,9% раствор натрия хлорида.

Приготовление 15% взвеси эритроцитов кролика и определение величины Lh токсина проводят по ОФС "Определение содержания антиальфастафилолизина (специфических антител) в сывороточных препаратах крови человека и животных".

Определение антитоксинсвязывающей способности анатоксина стафилококкового сопровождается четырьмя контролями:

1 - служит для коррекции учета результатов опытного ряда, т.к. в нем определяется количество МЕ (Международных единиц) антиальфастафилолизина, которое нейтрализует Lh токсина стафилококкового в условиях опыта. ОСО содержания антиальфастафилолизина разводят 0,9% раствором натрия хлорида до содержания 1 МЕ в 1 мл, разливают в ряд пробирок в объеме: 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2 мл и доводят общий объем в каждой пробирке 0,9% раствором натрия хлорида до 2,0 мл. Таким образом, первый контроль состоит из ряда пробирок, содержащих от 0,8 до 1,2 МЕ антиальфастафилолизина.

2 - контроль "полноты" нейтрализации Lh токсина стафилококкового специфическими антителами в условиях опыта. В пробирку наливают 1,0 мл раствора ОСО, разведенного до содержания 2 МЕ/мл и доводят общий объем 0,9% раствором натрия хлорида до 2,0 мл.

3 - контроль отсутствия спонтанного лизиса эритроцитов кролика. В пробирку вносят 2,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида.

4 - контроль гемолитического действия токсина стафилококкового на эритроциты кролика в условиях опыта. В пробирку вносят 2,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида.

Опытный ряд - испытуемый анатоксин разводят 0,9% раствором натрия хлорида в 8, 10, 12, 14 и 16 раз. Из приготовленных разведений по 1,0 мл переносят в пробирки и добавляют в них по 1,0 мл раствора ОСО антиальфастафилолизина, содержащего 2 МЕ/мл. Пробирки осторожно встряхивают и выдерживают 20 минут при температуре
°С.

Затем в пробирки опытного и контрольных рядов (кроме третьего) добавляют токсин стафилококковый в дозе Lh, установленной в день проведения испытания. Все пробирки встряхивают и выдерживают 20 минут при температуре от 18 до 22°С. Далее в каждую пробирку добавляют по 2 капли (0,1 мл) свежеприготовленной 15% взвеси эритроцитов с установленной в день проведения испытания величиной оптической плотности; пробирки вновь встряхивают и выдерживают в течение 1 ч при температуре °С, а затем - 1 ч при температуре °С.

Результаты учитывают визуально по степени гемолиза эритроцитов:

"-" - отсутствие гемолиза (надосадочная жидкость - прозрачная, бесцветная);

"+" - слабый гемолиз (надосадочная жидкость - слегка окрашена);

"++" - частичный гемолиз (надосадочная жидкость - окрашена);

"+++" - почти полный гемолиз (опалесцирующая окрашенная жидкость);

"++++" - полный гемолиз (прозрачная ярко окрашенная жидкость).

Учет результатов опыта начинают с учета результатов контроля: во втором и третьем контроле гемолиз эритроцитов должен отсутствовать.

Отсутствие гемолиза во втором контроле свидетельствует, о том, что антиальфастафилолизин в дозе 2 МЕ полностью нейтрализовал гемолитическое действие дозы токсина стафилококкового в опыте; в четвертом контроле должен произойти полный гемолиз эритроцитов.

Учет результатов опытного ряда проводят в сравнении с результатами первого контрольного ряда: учитывают первые пробирки, в которых произошел почти полный гемолиз "+++".

При оптимальных условиях опыта почти полный гемолиз "+++" должен произойти в пробирке контрольного ряда, содержащей 1 МЕ антиальфастафилолизина. В той пробирке опытного ряда, в которой зафиксирован также почти полный гемолиз "+++", вызываемый оставшимся свободным токсином стафилококковым, испытуемый анатоксин связал 1 МЕ антиальфастафилолизина и, следовательно, в ней содержится 1 ЕС (единица связывания) анатоксина.

Антигенная активность (антитоксическая способность) (АС) стафилококкового анатоксина, выраженная в единицах связывания (ЕС) проводится по следующей формуле:

, где

n - кратность разведения испытуемого анатоксина в опыте;

2 - количество МЕ антиальфастафилолизина в опыте;

а - количество МЕ антиальфастафилолизина, затраченное на нейтрализацию дозы токсина стафилококкового в первом контрольном ряду;

(2-а) - количество МЕ антиальфастафилолизина, связанное испытуемым анатоксином в условиях опыта, являющееся эквивалентом количества единиц связывания (ЕС) анатоксина в опыте.

Если почти полный гемолиз "+++" произошел в пробирке контрольного ряда, содержащей 1 ME антиальфастафилолизина. Аналогичный результат зафиксирован в пробирке опытного ряда, содержащей испытуемый анатоксин, разведенный в 12 раз. Следовательно, в 1,0 мл испытуемого анатоксина содержится 12 х (2-1)=12ЕС.

Если почти полный гемолиз "+++" произошел в пробирке контрольного ряда, содержащей 0,9 ME антиальфастафилолизина, и аналогичный результат получен в пробирке опытного ряда, содержащей испытуемый анатоксин, разведенный в 10 раз, то 1,0 мл испытуемого анатоксина содержит 10 х (2-0,9) = 10 х 1,1 = 11 ЕС;

Если почти полный гемолиз "+++" произошел в пробирке контрольного ряда, содержащей 1,1 ME антиальфастафилолизина, и аналогичный результат зафиксирован в пробирке опытного ряда, содержащей анатоксин, разведенные в 14 раз, то 1,0 мл испытуемого анатоксина содержит 14х (2 - 1,1) = 14 х 0,9 = 12,6 ЕС.

Производственный штамм

В частной фармакопейной статье этот раздел должен содержать следующую информацию: наименование штамма(ов); место их депонирования; морфологическую характеристику; при необходимости - допустимое количество пассажей и методику их проведения с указанием субстрата и условий культивирования; дополнительные к паспортным данным требования к характеристикам штаммов.

Показатели, которые отражают качество конечного продукта, но не могут быть определены в последнем, должны быть определены на промежуточных стадиях производства, что также должно быть отражено в частной фармакопейной статье.

Вспомогательные компоненты

Формальдегид - не более 30 мкг/мл. Испытание проводят по ОФС "Определение формальдегида".

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

Транспортирование и хранение.

Анатоксин стафилококковый очищенный, раствор для подкожного введения должен транспортироваться и храниться при температуре от 2 до 8 °С.

Замораживание не допускается.