Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42 "Определение бычьего сывороточного альбумина методом ракетного иммуноэлектрофореза"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42
"Определение бычьего сывороточного альбумина методом ракетного иммуноэлектрофореза"

Вводится взамен метода,
изложенного в ФС 42-3874-99

Данный метод предназначен для определения бычьего сывороточного альбумина в иммунобиологических лекарственных средствах (ИБЛС). Метод основан на способности антигена мигрировать в электрическом поле в гель, содержащий антисыворотку, результатом является реакция преципитации антигена с антисывороткой с образованием линии преципитации в виде пика (ракеты), высота которого пропорциональна концентрации внесенного антигена.

Определяют содержание бычьего сывороточного альбумина (БСА) методом ракетного иммуноэлектрофореза.

Метод ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ)

В химическую пробирку с 16 мл 1% геля агарозы, расплавленного и охлажденного до температуры 56°С прибавляют 16 мкл сыворотки против БСА с титром 1:1000 или 32 мкл сыворотки с титром 1:500 или 1,6 мл сыворотки, преципитирующей белки сыворотки крови рогатого скота (анти СРС) кроличьей диагностической для судебно-медицинских целей с титром антител 1:10000 и перемешивают. Содержимое пробирки выливают на стеклянную пластинку размером 120 х 90 мм, помещенную на ровную горизонтальную поверхность, толщина слоя агарозного геля должна

составлять  мм. После застывания геля агарозы пластинку накладывают на трафарет (рис. 1) и пробивают лунки пробойником диаметром 4 мм. Гель из лунок удаляют с помощью вакуумного насоса или иглы. Пластинку помещают в прибор для горизонтального электрофореза.

В камеры прибора наливают 1,5 л электродного буферного раствора. Соединяют поверхность агарозного геля с буферным раствором с помощью 4-х слойной фильтровальной бумаги размером 120 х 60 мм. Расстояние от края фильтровальной бумаги до лунок должно быть не менее 15 мм.

В лунки вносят по 15 мкл испытуемого образца и отечественного стандартного образца ОСО "Содержания бычьего сывороточного альбумин для построения калибровочного графика". Испытуемый образец вносят в 2 лунки. В случае использования сыворотки против СРС для выявления преципитата БСА из испытуемого образца готовят две пробы, одна содержит воду, а вторая - БСА в конечной концентрации 2 мкг/мл.

Время с начала нанесения образцов до включения прибора не должно превышать 10 мин. Условия проведения электрофореза; напряжении - 60 В на 1 см длины геля, сила тока - 6 мА, время - в течение 18 - 20 ч. По окончании электрофореза пластинку помещают в кювету с 0,9% раствором натрия хлорида и дважды промывают в течение 3 часов. По окончании электрофореза пластинку вынимают, накрывают фильтровальной бумагой, предварительно смоченной водой, прокалывают иглой отверстия над лунками (для устранения растрескивания геля) и высушивают при температуре 18 - 20°С. После высушивания с пластинки удаляют фильтровальную бумагу путем смачивания водой и переносят в кювету с красителем на 15 - 20 мин. Затем окрашенную пластинку помещают в кювету с раствором для обесцвечивания окрашенных гелей и выдерживают до достижения необходимой контрастности между преципитатом и фоном, далее пластинку промывают водой и высушивают при температуре 18 - 20°С. С помощью измерительной металлической линейки измеряют высоту пика (h), длина шкалы до 300 мм0,1 мм. Измерения делают от края лунки до максимума внешней высоты пика (ракеты) (рис. 2).

Содержание БСА в испытуемой пробе определяют по калибровочному графику.

Содержание бычьего сывороточного альбумина (БСА) должно находиться в диапазоне от 0,5 до 2,0 мкг/мл.

Построение калибровочного графика. ОСО "Содержания бычьего сывороточного альбумин для построения калибровочного графика" разводят в соответствии с инструкцией по применению до концентрации 2,0 мкг/мл. К 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 мл разведенного отраслевого стандартного образца прибавляют воду до 0,4 мл (концентрация БСА - 0,25; 0,5; 1,0; 1,5 мкг/мл). Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество БСА в мкг/мл, а по оси ординат высоту пика в мм. Калибровочный график должен проходить через начало координат.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Примечания.

Испытуемый образец. 15 мкл испытуемого образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье.

Получение сыворотки против бычьего сывороточного альбумина (сыворотка против БСА).

Кроликов породы Шиншилла массой 2,5 - 3,5 кг иммунизируют 0,15% раствором БСА. Используют БСА с содержанием белка не менее 95%. Раствор БСА готовят на 0,9% растворе натрия хлорида. 0,15 г БСА помещают в градуированный цилиндр вместимостью 100 мл и растворяют в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида, затем доводят объем раствора 0,9% раствором натрия хлорида до метки и перемешивают.

I цикл иммунизации состоит из двух инъекций 0,15% раствора БСА с интервалом 7 суток в дозе 1,0 мл в смеси с 1,0 мл адъюванта Фрейнда в область подколенных лимфатических узлов (последовательно в правую и левую лапу).

II цикл иммунизации проводят через 30 суток после I цикла, цикл состоит из пяти внутрибрюшинных инъекций с интервалом 2 суток в возрастающих дозах: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 мл (за 1 ч до первой инъекции проводится десенсибилизация - 0,1 мл 0,15% раствора БСА подкожно).

III цикл иммунизации проводят через 30 суток после II иммунизации, цикл состоит из трех внутривенных инъекций с интервалом 2 суток в возрастающих объемах: 0,5; 1,0; 1,5 мл 0,15% раствора БСА (за 1 ч до первой инъекции проводится десенсибилизация - 0,1 мл раствора БСА подкожно).

Через 7 суток после последней иммунизации у кроликов берут 2 - 3 мл крови и в сыворотке определяют титр антител против БСА методом ракетного иммунофореза (разведение сыворотки, дающее пик высотой 1 мм с раствором БСА в концентрации 0,5 мкг/кг). Сыворотка, имеющая титр не ниже 1:500, годна к дальнейшему использованию, в этом случае кроликов обескровливают тотально. Если титр сыворотки ниже 1:500, через 30 суток проводят IV цикл иммунизации (аналогичный третьему циклу), через 7 суток кроликов обескровливают тотально и устанавливают титр антител против БСА. Сыворотка, имеющая титр ниже 1:500, подлежит уничтожению.

При обескровливании кроликов кровь от каждого из них собирают в отдельный флакон.

Флаконы с кровью ставят в термостат при температуре °С на 60-65 мин, затем обводят образовавшийся сгусток пипеткой и оставляют при температуре 4 - 8°С на 18 - 20 ч, затем сыворотку отбирают в стерильную посуду, прибавляют борную кислоту из расчета 20 - 25 мг на 100 мл сыворотки и разливают по 0,5 мл в ампулы из стекла НС-1, ампулы запаивают и хранят при температуре минус °С в течение двух лет.

Приготовление концентрированного трис-боратного буферного раствора с трилоном Б (рН 8,6-8,8).

60,5 г трис(гидроксиметил)аминометана, 6,0 г трилона Б, 19,0 г борной кислоты последовательно растворяют в воде и доводят объем водой до 1 литра в мерном цилиндре. При необходимости раствор фильтруют через бумажный фильтр. Раствор хранят при температуре 2 - 8°С не более 3-х месяцев.

Приготовление электродного буферного раствора (рН 8,6-8,8).

Концентрированный трис-боратный буферный раствор с трилоном Б (рН 8,6-8,8) разводят водой в 5 раз. К 300 мл концентрированного трис-боратного буферного раствора с трилоном Б прибавляют 1200 мл воды очищенной и перемешивают. Раствор хранят при температуре 2 - 8°С не более 1 мес при 4-х кратном использовании.

Приготовление 1% геля агарозы.

1 г агарозы помещают в колбу, вместимостью 100 мл, прибавляют 80 мл воды и растворяют при нагревании на кипящей водяной бане, прибавляют 20 мл концентрированного трис-боратного буферного раствора с трилоном Б и вновь нагревают на кипящей водяной бане 30 мин. Гель агарозы разливают по 16 мл в химические пробирки вместимостью 20 мл. Гель агарозы хранят при температуре 4 - 8°С не более 2 месяцев.

Приготовление красителя.

0,5 г кислотного синего 92 растворяют в растворе, состоящем из 10 мл ледяной уксусной кислоты, 45 мл 96% раствора этилового спирта и 45 мл воды очищенной. Раствор красителя перемешивают, фильтруют и хранят при комнатной температуре в течение 3 мес.

Приготовление раствора для обесцвечивания.

К 200 мл ледяной уксусной кислоты прибавляют 500 мл этилового спирта, 300 мл воды и перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 3 мес.

Подготовка стеклянных пластинок.

На стеклянные пластинки размером 120 х 90 мм, обработанные хромовой смесью, наносят 1 мл 1% расплавленного геля, растирают его по поверхности пластинки с помощью стеклянной пипетки и подсушивают. Подготовку стеклянных пластинок проводят непосредственно перед использованием.