Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС "Вакцина гриппозная инактивированная"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС
"Вакцина гриппозная инактивированная"

Вводится впервые

Настоящая фармакопейная статья распространяется на Вакцину гриппозную инактивированную (вакцину цельновирионную, которая представляет собой цельный вирус, вакцину расщепленную, которая состоит преимущественно из разрушенных вирусных частиц, вакцину субъединичную, которая содержит в основном поверхностные антигены вируса гриппа: гемагглютинин и нейраминидазу). Антигены получают из очищенного вируса или очищенных вирусов гриппа типа А и В, одного, двух или трех штаммов, выращенных раздельно в развивающихся куриных эмбрионах.

Препарат вызывает формирование специфического иммунитета против гриппа.

Вакцина предназначена для специфической профилактики гриппа.

Может содержать адъювант. С консервантом или без консерванта.

Штаммовый состав вакцин ежегодно рекомендуется ВОЗ и национальной Комиссией по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам.

Куриные эмбрионы должны быть получены из птицехозяйств, благополучных по возбудителям, патогенным для человека. Качество поставляемых эмбрионов должно быть подтверждено ветеринарными свидетельствами.

Производство

Производство вакцины должно осуществляться в помещениях, где не проводят работы с другими патогенными микроорганизмами и антибиотиками. Не допускается производство препарата на территории, на которой расположены производственные здания по производству антибиотиков, если не соблюдены требования к защитным зонам, согласно действующим санитарным правилам. Обязательным условием технологического процесса производства вакцины является соблюдение поточности, исключающей возможность перекреста промежуточных продуктов и полуфабрикатов, получаемых на разных стадиях производства, и их контаминацию посторонними веществами, в первую очередь посторонней микрофлорой. Работы с живым и инактивированным вирусом должны проводиться в разных помещениях. При производстве необходимо проводить валидацию технологического процесса, технологического оборудования, сырья и методов контроля. Все исходные материалы и сырье, используемые при производстве, должны иметь сертификаты соответствия (допустимо только фармакопейное качество используемых компонентов). В состав вакцины должны входить вспомогательные компоненты, разрешенные к медицинскому применению и в дозах, не вызывающих токсические, аллергические или иные нежелательные реакции у человека.

Контроль показателей качества должен включать в себя биологические, вирусологические и аналитические методы. В связи с этим при производстве особое значение имеет постоянное выполнение на всех этапах производства внутрипроизводственного анализа показателей качества, оценки воспроизводимости методов и анализа качества готовой продукции при выпуске и на конце срока его годности.

Производство вакцины включает несколько стадий с обязательным внутрипроизводственным контролем: получение посевного вируса; накопление вируса; его очистку и концентрацию; при необходимости расщепление вируса; производство препарата: маркировку; фасовку. На каждой стадии должны быть предусмотрены: система и схема анализа важных показателей качества в ходе технологического процесса и испытания конечного продукта; хранение промежуточных и конечного продуктов, обеспечивающее стабильность качества в течение срока годности продукта.

Системы контроля качества необходимы для оптимизации разработки производственного процесса: спецификации сырья, промежуточных продуктов и конечного продукта; контроль изменений; расследование нарушений и жалоб. Главная цель комплексной производственной программы - на постоянной основе производить лекарственный препарат, который безопасен и эффективен.

На этапах производства необходимо контролировать:

- Качество сырья: 9 -11-дневных куриных эмбрионов.

- Производственные штаммы: используются высокорепродуктивные реассортанты. Источник и история пассажей должны быть известны. Продукция вакцины основывается на системе посевных вирусов (seed-lot). Из штамма готовится маточный материал или главный посевной вирус, который должен храниться при -70°C в жидком виде или при - 20°C в лиофильно высушенном. Штаммы и маточный материал должны быть проверены по всем биологическим свойствам в соответствии с регламентированными требованиями.

Из маточного материала готовят рабочий посевной вирус, который должен быть не более чем 15 пассажем от соответствующего производственного штамма. Финальный сбор представляет собой первый пассаж от рабочего посевного вируса.

- Моновалентный вирусный сбор: антимикробный агент может быть добавлен. Пенициллин или стрептомицин нельзя использовать ни на одной из стадий производства. Процесс инактивации должен обеспечивать инактивацию вируса лейкоза птиц и микоплазм. При использовании формальдегида его концентрация не должна превышать 0,2g/l на любой стадии. Если используется бетапропилактон, его концентрация не должна превышать 0,1% V/V.

Для каждого нового штамма необходима валидация процесса расщепления вируса в моновалентном препарате сплит вакцины и подтверждение наличия преимущественного содержания гемагглютинина и нейраминидазы в субъединичных моновакцинах.

- Готовая лекарственная форма

Описание. Бесцветная или слегка желтоватая прозрачная, возможно слегка опалесцирующая жидкость. Определяют визуально.

Подлинность. Каждый подтип и тип антигена должен нейтрализоваться гомологичной сывороткой. Титр с гетерологичной сывороткой должен быть ниже ее собственного титра, по крайней мере, в 4 раза. Определение проводят на стадиях получения полуфабрикатов: объединенного вирусного концентрата или моновакцины в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Метод постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с вирусом гриппа (макрометод). РТГА применяют для установления типа и подтипа вируса, т.е. специфичности, а также для определения нарастания титров специфических антител. Постановка РТГА включает следующие этапы работы: приготовление взвеси эритроцитов, определение гемагглютинирующего титра антигена в РГА и рабочей дозы вируса, постановка самой реакции. Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты: - антиген (вакцина, вируссодержащая жидкость - аллантоисная или культуральная); - иммунные сыворотки к различным вирусам гриппа; - буферно-солевой раствор рН (Na-фосфатный буфер 0,01 М с 0,16 М NaCl); - взвесь куриных эритроцитов, 1%.

1. Приготовление взвеси куриных эритроцитов.

Для постановки РТГА используют эритроциты петухов. Кровь у петухов берут из сердца или подкрыльцовой вены.

Свежеполученную от 3-5 петухов кровь помещают во флакон со стеклянными бусами или же с одним из антикоагулянтов (раствор Альсевера, 5% раствор лимоннокислого натрия). Дефибринирование крови проводят немедленно путем интенсивного встряхивания флакона в течение 5-7 мин при температуре °С до выпадения волокон фибрина.

Дефибринированную кровь фильтруют через 4 слоя марли, затем трехкратно отмывают буферно-солевым раствором (на 1 объем крови - 4 объема буферно-солевого раствора) путем центрифугирования при об/мин в течение мин. Надосадочную жидкость удаляют. Из осадка, принимаемого за 100%, готовят 1% суспензию куриных эритроцитов по объему.

2. Определение гемагглютинирующего титра антигена.

В лунках плексигласовой планшеты готовят двукратные разведения антигена в объеме 0,4 мл на буферно-солевом растворе, начиная с 1:10 до 1:1280. В каждую лунку вносят по 0,4 мл 1% суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием планшеты и оставляют при температуре °С на 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле, см. ниже).

Реакцию оценивают по -крестовой системе. За титр антигена, или одну агглютинирующую единицу (1АЕ), принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов (3 или 4 креста).

Определение титра антигена сопровождается отрицательным контролем на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. С этой целью в контрольную лунку той же плексигласовой доски вносят 0,4 мл буферно-солевого раствора и 0,4 мл 1% суспензии эритроцитов. При отсутствии спонтанной агглютинации на дне лунки выпадает гомогенный с ровными краями осадок эритроцитов (отрицательная реакция).

3. Приготовление рабочей дозы антигена.

В РТГА рабочей дозой антигена является то разведение антигена, в 0,2 мл которого содержится 4 агглютинирующие единицы (4 АЕ). Для вычисления ее следует установленную величину титра антигена разделить на 8. Полученная от деления цифра указывает во сколько раз нужно развести антиген, чтобы в 0,2 мл его содержалось 4 АЕ (рабочая доза).

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (4 АЕ). Для этого в пять лунок горизонтального ряда плексигласовой доски, начиная со второй, вносят по 0,2 мл буферно-солевого раствора. В 1-ю и 2-ю лунки добавляют по 0,2 мл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания переносят 0,2 мл смеси из 2-й лунки в 3-ю, из 3-ей - в 4-ю, из 4-й - в 5-ю, из 5-й лунки 0,2 мл удаляют. Затем в каждую лунку добавляют по 0,2 мл буферно-солевого раствора и по 0,4 мл 1% суспензии куриных эритроцитов. В 6-й лунке ставят контроль на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов (см. выше). После встряхивания смесь оставляют при температуре °С на 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле).

При правильном выборе рабочей дозы полная (++++) агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в первых трех лунках. В 4-й и 5-й лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного выше, разведение антигена должно быть изменено путем добавления соответствующего количества антигена или буферно-солевого раствора для получения необходимой рабочей дозы. При этом необходимо повторно проверить правильность приготовления рабочей дозы.

4. Постановка реакции торможения гемагглютинации.

Сыворотки, используемые в РТГА, могут содержать неспецифические ингибиторы гемагглютинации. Поэтому для их удаления перед постановкой РТГА сыворотки необходимо обработать нейраминидазой холерных вибрионов (см. Примечание).

После удаления неспецифических ингибиторов готовят двукратные разведения сывороток в лунках плексигласовой доски, начиная с 1:10 до 1:640 и выше в объеме 0,2 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют по 0,2 мл рабочей дозы антигена (4 АЕ). Смесь встряхивают, оставляют при температуре °С на 30 мин, затем в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1% суспензии куриных эритроцитов. Смесь повторно встряхивают, оставляют при температуре °С в течение 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле), после чего производят учет результатов реакции (см. п. 4.1.6).

При наличии специфических антител в сыворотке наступает задержка агглютинации эритроцитов. За титр сыворотки принимают предельное разведение, вызывающее полную задержку гемагглютинации.

Задержка гемагглютинации указывает на соответствие типа антигена и взятой сыворотки; отсутствие задержки гемагглютинации свидетельствует о несоответствии типа взятой сыворотки.

Примечание. Удаление неспецифических ингибиторов гемагглютинации из иммунных сывороток с помощью нейраминидазы холерных вибрионов.

При наличии инструкции по применению нейраминидазы (коммерческий реактив) необходимо следовать требованиям, изложенным в данном документе.

Метод основан на способности нейраминидазы холерных вибрионов, не действуя на специфические антитела, разрушать ингибиторы гемагглютинации к вирусам гриппа А и В в сыворотках крови человека, кур, крыс, кролика.

К смеси (сыворотка плюс нейраминидаза) добавляют 0,4 мл буферно-солевого раствора, чтобы получить разведение сыворотки 1:10.

Сыворотка, обработанная нейраминидазой, может быть использована для РТГА в течение 2 недель при условии хранения ее при температуре °С.

5. Приготовление растворов.

Приготовление буферно-солевого раствора рН

(0,1 М Na-фосфатный буфер, содержащий 0,15 М NaCl):

17,8 г натрия гдрофосфата растворяют в дистиллированной воде и объем в мерной колбе доводят до 1 л (0,1 М ).

13, дигидрофосфата натрия растворяют в дистиллированной воде и объем в мерной колбе доводят до 1 л (0,1 М ).

к 720 мл 0,1 М раствора Na2HPO4 добавляют 280 мл 0,1 М раствора . рН такого раствора должен быть равным .

100 мл полученного 0,1 М Na-фосфатного буфера разбавляют дистиллированной водой до 1 л и добавляют 8,5 г натрия хлорида (NаCl). рН полученного раствора - . Если рН выше или ниже требуемого, добавляют 1 N раствор HCl или 1 N раствор NaOH, соответственно.

Приготовление раствора Альсевера

Состав:

- 2,05% глюкозы;

- 0,42% натрия хлорида;

- 0,8% натрия цитрата;

- 100,0 мл бидистиллированной воды.

Реакцию среды раствора доводят с помощью 5% лимонной кислоты до рН от 6,15 до 5,6 (примерно 10 мл кислоты на 1 л раствора). Стерилизуют фильтрацией или автоклавированием в течение 3 последовательных дней при 100°С и 0,7 атм. Для консервирования добавляют на 1 мл крови 1,2 мл раствора Альсевера.

В этом виде эритроциты можно хранить при °С в течение 1-2 нед. Перед употреблением их необходимо трехкратно отмыть буферно-солевым раствором с помощью центрифугирования при об/мин в течение 10 мин.

Приготовление консервирующего раствора 5% натрия цитрата

5% раствор цитрата натрия на дистиллированной воде перед употреблением разводят в 2 раза буферно-солевым раствором и к одной части полученного раствора натрия цитрата добавляют 2 части крови. В этом консерванте эритроциты можно хранить при °С в течение 3-5 суток.

Метод постановки реакции торможения гемагглютинации

(РТГА) с вирусом гриппа (микрометод).

Принцип метода, его учет и ингредиенты для реакции, проводимой микрометодом, те же, что и для проведения РТГА макрометодом. Изменяются только концентрации и объемы ингредиентов.

Реакцию ставят на микропанели с "U"-образными лунками.

1. Приготовление 0,5% взвеси эритроцитов петуха.

Взвесь готовят из 1%-ной суспензии эритроцитов (см. макрометод) разведением ее в 2 раза (т.е. в соотношении 1:1) буферно-солевым раствором.

2. Определение гемагглютинирующего титра антигена.

В каждую лунку микропанели вносят буферно-солевой раствор в объеме 50 мкл. Затем в первую лунку вносят 50 мкл антигена в разведении 1:10 и далее проводят титрование по принципу двукратного разведения. Из последней лунки удаляют 50 мкл. Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл 0,5% суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре °С на 40-45 мин до оседания эритроцитов в контроле (см. ниже).

Реакцию оценивают по 4х-крестовой системе. За титр антигена или одну агглютинирующую единицу (1 АЕ) принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов на 3 или 4 креста.

Определение титра антигена сопровождается постановкой отрицательного контроля на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. В качестве отрицательного контроля служат несколько лунок панели, в которые вместо антигена внесен буферно-солевой раствор.

3. Приготовление рабочей дозы антигена.

Рабочая доза антигена при постановке РТГА микрометодом равна 8 АЕ. Для ее приготовления гемагглютинирующий титр делят на 16. Полученная цифра означает, во сколько раз необходимо развести антиген.

Пример: титр антигена равен 1:160. Разделив 160 на 16, получаем цифру 10, указывающую, что антиген необходимо развести в 10 раз.

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (8 АЕ). Для этого в шесть лунок микропанели, начиная со второй, вносят по 25 мкл буферно-солевого раствора. В 1-ю и 2-ю лунки добавляют по 25 мкл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания смеси 25 мкл ее объема переносят из 2-й лунки в 3-ю, из 3-ей - в 4-ю и т.д. Из последней лунки панели 25 мкл удаляют. Затем во все лунки добавляют по 25 мкл буферно-солевого раствора и по 50 мкл 0,5% суспензии эритроцитов. После встряхивания смесь оставляют при температуре °С на 40-45 мин до оседания эритроцитов в контроле.

При правильном выборе рабочей дозы агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в четырех лунках панели. В остальных лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного результата добавляют антиген или буферно-солевой раствор для получения необходимой рабочей дозы.

4. Постановка реакции торможения гемагглютинации.

Метод постановки реакции микрометодом соответствует таковому, описанному для макрометода, за исключением объемов используемых ингредиентов реакции.

Готовят двукратные разведения сыворотки в объеме 25 мкл, вносят рабочую дозу антигена (8 АЕ) в объеме 25 мкл и после контакта антигена и сыворотки (от 30 мин до 1 ч) при температуре °С в каждую лунку панели вносят по 50 мкл 0,5%-ной взвеси эритроцитов. После оседания эритроцитов в контроле (как правило, через 40-45 мин) проводят учет результатов.

За титр сыворотки принимают величину обратную ее разведению, при котором отсутствует агглютинация эритроцитов.

Прозрачность. Должен выдерживать сравнение с эталоном I. Определяют визуально по ОФС, "Прозрачность и степень мутности жидкостей"

Цветность. Интенсивность окраски раствора не должна быть более эталона . Определяют визуально по ОФС "Степень окраски жидкостей"

Механические включения. Должен выдерживать требования при определении видимых механических включений по ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

рН. От 7,0 до 7,6. Определяют потенциометрическим методом по ОФС, "Ионометрия".

Извлекаемый объем. Не менее номинального.

Определение проводят по ОФС, "Извлекаемый объем".

Белок. Не более 100 мкг на дозу для цельновирионных и расщепленных вакцин для каждого из входящих в состав вакцины штамма. Не более 40 мкг на дозу для субъединичных вакцин за вычетом количественного содержания гемагглютинина для каждого из входящих в состав вакцины штамма. Определение проводят по ОФС, "Определение белка", "Метод Лоури", если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Стерильность. Должен быть стерильным. Определяют по ОФС "Стерильность".

Бактериальные эндотоксины. Не более 100 ЕЭ/доза. Определение проводят методом гель-тромб теста по ОФС, "Бактериальные эндотоксины". Чувствительность используемого ЛАЛ-реактива должна быть указана в частной ФС.

Пирогенность. Должен быть апирогенным. Определение проводят по ОФС, "Пирогенность". Тест-доза 0,1 мл вакцины на кг массы кролика. Проведение теста не требуется при наличии определения эндотоксина.

Аномальная токсичность. Должен быть нетоксичным.

Определение проводят по ОФС, "Аномальная токсичность", раздел "Тест для вакцин и сывороток". Доза для мышей и морских свинок 0,5 мл внутрибрюшинно.

Специфическая безопасность. Не должен содержать живого вируса гриппа.

Определение отсутствия живого вируса проводят путем заражения 10 куриных эмбрионов (9-11-дневных) по 0,2 мл препарата в аллантоисную полость. Через 48 ч - для вируса гриппа типа А и через 72 ч - для вируса гриппа типа В инкубации эмбрионов в термостате при 35°-37 °С аллантоисную жидкость проверяют на наличие гемагглютиниа с эритроцитами петухов (1%- суспензия). Не менее 7 из 10 куриных эмбрионов должны остаться живыми. Собирают по 0,5 мл аллантоисной жидкости из каждого эмбриона, объединяя жидкость от всех групп. Затем заражают по 0,2 мл неразведенной смеси аллантоисной жидкости 10 эмбрионов. Эмбрионы инкубируют при тех же условиях, после чего определяют наличие гемагглютининов аллантоисной жидкости после второго пассажа. Результаты реакции после 2-го пассажа должны быть отрицательными. Допускается проведение 3-его пассажа.

Специфическая активность. Должен содержать гемагглютинин вируса гриппа подтипов и и типа В не более 15 мкг на дозу. Требование к количественному содержанию гемагглютинина в дозе формулируют на основании результатов клинических испытаний по иммуногенности. Специфическую активность определяют в реакции одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД).

Принцип метода.

Гемагглютинин (ГА), диффундируя из лунок агарозного геля в радиальном направлении, реагирует со специфическими антителами сыворотки, находящейся в агарозе, и образует в геле зону преципитации. Размеры окружающей лунку зоны преципитации находятся в прямой зависимости от количества антигена, внесенного в лунку.

1. Ингредиенты для проведения ОРИД:

- стандарт моноспецифической сыворотки к гемагглютинину вируса гриппа;

- стандартный антиген (гемагглютинин) вируса гриппа;

- агароза;

- детергент;

- краситель - Кумасси бриллиантовый голубой;

- раствор для обесцвечивания агарозных гелей;

- буферно-солевой раствор (БСР): 0,01 М фосфатный буферный раствор рН 7,2 (по ГФ XII), содержащий 0,15 М натрия хлорида и 0,01% натрия азида. Можно вместо БСР использовать 0,01 М трис-НСl буфер рН 7,2-7,3, содержащий 0,15 М натрия хлорида и 0,01% натрия азида;

- 1-10% натрия азид.

2. Приготовление стандартных образцов иммунореагентов.

2.1. Приготовление стандарта моноспецифической сыворотки к гемагглютинину вируса гриппа.

Иммунизируют кролика или барана гемагглютинином, который должен содержать белок (не менее 100 мкг/мл), быть электрофоретически гомогенным при электрофорезе в полиакриламидном геле. Моноспецифические сыворотки получают иммунизацией животных очищенным белком гемагглютинина с равным объемом адъюванта Фрейнда. Первая иммунизация по 0,5 мл смеси в две точки, вторая и третья иммунизация - через 2 недели в том же объеме в две точки внутримышечно и по 0,1 мл гемагглютинина без адъюванта в четыре точки внутрикожно. Обескровливание животных проводится через 2 недели. Предварительно проводится отбор пробной партии крови. При необходимости проводят дополнительно введение антигена. Титр сыворотки в РТГА должен быть не ниже 1:5000.

Полученную сыворотку прогревают при температуре 56°С, разводят БСР, содержащим 0,01% азида натрия, в 2-4 раза в зависимости от активности, разливают по 0,5 мл в ампулы и высушивают.

2.2. Приготовление стандартного антигена (ГА) вируса гриппа.

Стандарт гемагглютинина (антиген) для ОРИД должен содержать 20-50 мкг ГА в 1 мл и не ниже 1:32000 ГАЕ.

Используют полуфабрикат инактивированной гриппозной вакцины с содержанием белка 25-400 мкг/мл. Соотношение экстинкции полуфабриката должно быть 1,1-1,18. Содержание сахарозы - 5-7% (в случае отсутствия сахарозы подбирают наполнитель для сушки). Жидкий препарат разливают по 1,0 мл в ампулы и подвергают лиофильной сушке.

3. Оборудование:

- стеклянные пластины 6х9 см;

- микрошприц на 0,1 мл или автоматические микропипетки (импортные, Labsystems или другой зарубежной фирмы), регулируемые на 0-20 мкл, а также автоматические пипетки объемом 100-1000 мкл;

- водяная баня (до 100°С);

- прибор для измерения диаметра колец преципитации;

- горизонтальный столик с уровнем;

- камера (влажная) для инкубации;

- пробойник из нержавеющей стали с внешним диаметром 4 мм.

4. Проведение ОРИД.

Для реакции используют тщательно вымытые и сухие пластины размером 6х9 см. Для этого пластины кипятят в воде с добавлением моющих средств, затем промывают водопроводной и дистиллированной водой, помещают на сутки в раствор 1 N едкого натра и затем на сутки в смесь Никифорова (спирт: эфир = 1:1). Обезжиренные пластины промывают водопроводной и дистиллированной водой и высушивают.

Перед нанесением агарозы пластину равномерно протирают марлей, смоченной расплавленной горячей агарозой, для последующего закрепления геля на пластине. Приготовленные заранее порции агарозы объемом по 12 мл расплавляют в кипящей водяной бане при температуре 100°С и затем охлаждают до 56°С в водяной бане в течение не менее 30 мин. При 56°С к агарозе добавляют предварительно подогретую моноспецифическую сыворотку в объеме, указанном в описании к стандарту. Агарозу с сывороткой тщательно перемешивают, не допуская образования пузырьков воздуха. Расплавленную агарозу с сывороткой быстро и равномерно наносят на пластины, помещенные на столик с "уровнем", и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Приготовленные пластины с сывороткой можно хранить во влажной камере при 4°С в течение 6-7 сут.

В застывшей агарозе пробойником из нержавеющей стали с внешним диаметром 4 мм делают 6 рядов лунок по 4 лунки в каждом на расстоянии не менее 1,5 см от края пластины. Расстояние между лунками должно быть не менее 1 см. Агарозу из прорезанных лунок удаляют под легким вакуумом.

Определение специфической активности вакцин, т.е. содержания антигена, гемагглютинина (ГА) в мкг/мл, проводят на двух пластинах. На каждой пластине исследуют стандарт и две серии вакцины, отводя под каждый образец по два ряда лунок. На второй пластине проверяют те же образцы, но расположение вакцин и стандарта произвольно меняют. Предварительно готовят смесь детергента и антигенов (50 мкл детергента + 450 мкл антигена), инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем готовят разведения антигенов: неразведенный антиген, 0,75, 0,5 и 0,25 (или 1:0, 3:1, 1:1, 1:3), используя для разбавления БСР.

Таблица 1- Схема разведений антигена

Разведение	Объем в мкл
	Антиген	Растворитель
неразвед.1:0	100	0
0,753:1	150	50
0,51:1	100	100
0,251:3	100	300

Для реакции важно, чтобы вакцина и стандартный антиген содержали близкие количества ГА, так, чтобы размеры зон преципитации могли быть сравнимы. Если вакцина, согласно паспортным данным, содержит меньше ГА, чем стандарт, необходимо провести предварительное разведение стандарта и, наоборот: в случае если стандарт менее активен, чем вакцина, то разводится вакцина. В описании к стандарту указаны рекомендуемые разведения стандарта и сыворотки.

В лунки вносят по 10 или по 20 мкл каждого разведения, начиная с разведения 1:3, с помощью микрошприца или, что точнее, - с помощью автоматической микропипетки со сменой наконечников при переходе от одного разведения к другому. Через 30 мин пластины помещают во влажную камеру на 18-24 ч при комнатной температуре. Затем для удаления из геля неспецифических белков пластины помещают в БСР на несколько часов при 2-3х-кратной смене БСР. После этого слой геля покрывают смоченной в БСР плотной фильтровальной бумагой, избегая образования воздушных пузырьков на поверхности геля, затем несколькими слоями сухой фильтровальной бумаги и помещают под груз (не более 10 г на 1 поверхности). Бумагу, за исключением первого слоя, меняют через каждые 10-15 мин до тех пор, пока она не перестанет впитывать влагу из агарозы. Для дальнейшего высушивания пластины помещают под вентилятор, не снимая первого слоя бумаги. Высушивают до момента, когда фильтровальная бумага первого слоя будет свободно отделяться от агарозы. Заливают красителем и окрашивают не менее 30 мин. После окрашивания обесцвечивают в растворе для обесцвечивания гелей до проявления четких колец преципитации на слабо окрашенном фоне. После подсушивания кольца преципитации измеряют в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Затем рассчитывают квадраты диаметров колец преципитации каждого антигена на основании средних величин по двум пластинам и строят график, откладывая по оси ординат квадраты диаметров, а по оси абсцисс - разведения антигенов. На графике зависимость квадрата диаметров от разведений для каждой вакцины должна быть выражена прямой линией, которая должна располагаться по оси ординат в пределах 3  от стандартной кривой. Если расстояние между начальными точками тестируемого и стандартного антигена превышает 3  , такие результаты не учитывают; в этом случае необходимо более точно подобрать концентрации антисыворотки и антигенов. Затем на оси ординат между начальными точками кривой стандарта и каждого антигена находят среднюю точку, от нее проводят прямую, параллельную оси абсцисс, а от нее на уровне разведения 1:3 находят расстояния до кривой тестируемого антигена и стандартного (см. рис. 2). Количество ГА в вакцине рассчитывают по формуле:
, где - расстояния по перпендикуляру на уровне разведения 1:0 от срединной линии до пересечения с кривыми тестируемого и стандартного антигенов, соответственно.

а - содержание ГА в мкг/мл в стандарте,

в - предварительное разведение вакцины,

x - содержание ГА в мкг/мл в вакцине.

Учет результатов ОРИД можно проводить используя программное обеспечение (например, "проводится с использованием специализированного решения Single Radial Immunodiffusion (SRID) программы "Siams Photolab", c 2004 -2008, СИАМС_, согласно руководству к программе"). При этом необходимо проведение валидации.

Приготовление рабочих растворов и разведений иммунореагентов.

Моноспецифическая сыворотка к ГА.

Разводят водой очищенной до объема, указанного на ампуле; последующие разведения получают с помощью БСР.

Стандартный антиген.

Разводят водой очищенной в объеме, указанном на ампуле; дальнейшие разведения получают с помощью БСР. Растворенный антиген хранят при 4 °С не более 6 ч.

Агароза.

Используют агарозу типа фирмы "Sigma" (США) или "Serva" (Германия) и другие. Агарозу заливают БСР (конечная концентрация 1,5%) и нагревают в кипящей водяной бане до полного растворения. Расплавленную агарозу фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, разливают по 12 мл и перекрывают резиновыми пробками. В таком виде агароза может храниться не менее 3 мес. при комнатной температуре. (Если агароза начинает отделяться от стенок пробирки, ее не используют).

Детергенты.

Используют детергенты, указанные в описании к стандарту. Обычно применяют: 5% лаурилсаркозинат натрия (саркозил натрия) NL 97, фирмы Ciba Geigi (США) или 20% (по объему) малгофен (триди-силоксиполи- (этиленокси) -этанол) ВС - 720, GAF International Operations, (США), или отечественный детергент - 10% Дезинтегрон-Б, аналог детергента Zwittergent 3-14 (Calbiochem-Behring, La Jolla, CA, CША) и другие. Растворы детергентов готовят на дистиллированной воде и хранят при комнатной температуре в течение 6 мес.

Краситель.

Используют Кумасси бриллиантовый голубой G-250 или R-250 фирмы "Serva", (Германия) и другие. Готовят 0,3% раствор в растворе для обесцвечивания гелей и фильтруют. Краситель хранится при комнатной температуре и может использоваться до выпадения в осадок кристаллов.

Раствор для обесцвечивания окрашенных агарозных гелей.

200 мл ледяной уксусной кислоты смешивают с 500 мл этилового спирта и доводят объем до 1 л водой очищенной. Раствор хранят неограниченное время в посуде с притертой пробкой.

Вещества, вносимые в препарат. Выполняются тесты определения содержания соответствующих химических веществ, указанных в частной фармакопейной статье, используемых для разрушения вируса, его инактивации и вспомогательные вещества.

Все исходные материалы и сырье, используемые при производстве, должны иметь сертификаты соответствия (допустимо только фармакопейное качество используемых компонентов). В состав вакцины должны входить вспомогательные компоненты, разрешенные к медицинскому применению и в дозах не вызывающих токсические, аллергические или иные нежелательные реакции у человека.

Мертиолят. От 42,5 до 57,5 мкг на дозу. Определение проводят колориметрическим или методом атомно-абсорбционной спектрометрии по ОФС, "Определение мертиолята".

Овальбумин. Не более 1мкг на дозу. Определение проводят иммуноферментным анализом с тест- системой для количественного определения овальбумина в жидкости. Конкретные условия проведения анализа указывают в частной ФС.

Иммуногенность. Для оценки иммуногенности должны быть взяты парные сыворотки (до вакцинации и через 21-28 дней после вакцинации). Обе сыворотки титруют одновременно в РТГА с эритроцитами петуха (см. раздел подлинность). Титр в РТГА менее 1:10 оценивается как 1:5.

Показатели иммуногенности для серонегативных (с исходным титром не более 1:20):

- Число лиц с четырехкратным и более увеличением титра антител (сероконверсия) должно быть > 40%.

- Увеличение среднегеометрического титра > 2,5 раза.

- Процент лиц с защитным титром антителом должно быть > 70%.

По крайней мере, один показатель должен отвечать вышеуказанным требованиям.

Контролируют три первые серии вакцины, содержащие новый вакцинный штамм, по данным исследования в РГГА парных сывороток добровольцев, полученных до иммунизации и после нее по методу, описанному в разделе "Подлинность".

Каждую серию вакцины испытывают на 30 человеках в возрасте от 18 лет.

Реактогенность. Вакцина должна быть ареактогенной или слабо реактогенной.

У части привитых могут наблюдаться местные и общие реакции различной степени выраженности; гиперемия, болезненность, припухлость в месте введения; недомогание, головная боль, повышение температуры. Местные реакции должны исчезать в течение от 1 до 3 суток (очень редко - до 5 суток), общие - в течение 3 суток. Допустимые реакции и их количество определяют для каждого конкретного препарата по результатам клинических исследований.

Контролируют три первые серии вакцины, содержащей новый вакцинный штамм. Каждую серию вакцины испытывают на той же группе людей численностью 30 человек в возрасте от 18 лет, на которой определяют иммуногенность.

Производственные штаммы. Штаммы вирусов гриппа типа А и В для производства вакцин должны быть рекомендованы ВОЗ, ЕС и национальной Комиссией по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам. Должны соответствовать по антигенной структуре антигенной разновидности вирусов гриппа подтипов и и типа В на текущий эпидсезон, с известными историей пассажей и источника выделения.

Штаммы должен отвечать следующим требованиям:

- быть адаптированными к куриным эмбрионам и не требовать дополнительной аттенуации;

- быть бактериологически стерильными, не содержать посторонних вирусов, микоплазм и микобактерий туберкулеза; быть специфичными в РТГА и РИНА (реакция ингибирования нейраминидазной активности) со штаммоспецифическими противогриппозными сыворотками;

- быть нетоксичными для белых мышей

- иметь в лиофилизированном виде инфекционную активность на куриных эмбрионах не ниже  мл;

- должны вызывать накопление гемагглютининов в аллантоисной жидкости зараженных куриных эмбрионов в титре не ниже 1:256.

Маркировка и упаковка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)". Вторичная (потребительская) упаковка кроме общепринятых должна содержать сведения о субстрате культивирования, составе штаммов, эпидсезоне, для которого предназначен препарат, количестве гемагглютинина каждого штамма в дозе, наличие или отсутствие консерванта.

Транспортирование. При температуре от 2 до 8°С. Замораживание не допускается.

Хранение. В сухом месте при температуре от 2 до 8°С .