Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42- "Требования к клеточным культурам - субстратам производства МИБП"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42-
"Требования к клеточным культурам - субстратам производства МИБП"

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья устанавливает требования к перевиваемым клеточным культурам (ПКК) человека и животных - диплоидным и гетероплоидным, применяемым в качестве субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП).

Применение ПКК для производства и контроля МИБП основано на системе создания банков посевных (БПК) и рабочих (БРК) клеток.

Термины и определения.

Клеточная линия (КЛ) - популяция клеток с определенными характеристиками, полученная путем последовательного субкультивирования первичной ткани донора.

Посевные клетки (ПК) - клеточная линия, полученная из одного вида ткани донора, сохраняемая в виде равных частей однородного состава при минус 196°С

на определенном уровне пассажа, одна или несколько из которых используется для создания посевного банка.

Банк посевных клеток (БПК) - запас клеток, полученных из одного типа посевной клеточной линии, хранящихся в виде кратных частей на определенном уровне пассажа при минус 196°С. Предназначен для создания банка рабочих клеток.

Банк рабочих клеток (БРК) - запас клеток однородного состава, полученных из одного или нескольких контейнеров БПК на определенном уровне пассажа, сохраняемых при минус 196°С, в виде кратных частей, используемых для получения производственной клеточной культуры.

Производственная клеточная культура (ПКК) - клетки, полученные из одного или нескольких контейнеров БРК и используемые для производства МИБП.

Диплоидные клеточные культуры (ДКК) - однородная популяция клеток человеческого или животного происхождения с ограниченным сроком жизни и сохраняющая диплоидный кариотип, идентичный донору.

Гетероплоидные клеточные культуры (ГКК) - однородная популяция клеток человеческого или животного происхождения с неограниченным сроком жизни и стабильно сохраняющая специфические свойства при длительном культивировании.

Посторонние агенты - бактерии, грибы, микоплазмы, спироплазмы, микобактерии, риккетсии, протозоа, паразиты, TSE-агенты, вирусы и др., которые случайно попали в производственный процесс получения МИБП.

ДНК инфекционная - вирусная ДНК, способная внедрятся в клеточную ДНК и вызывать образование пролиферирующих клонов.

Конец репродукции клеток - максимальный уровень пассажа, полученный во время производственного процесса.

Контрольные клетки - незаражённые вакцинным вирусом клетки производственной культуры, выращиваемые в условиях, в которых осуществляется производство субстрата, включая использование тех же серий питательной среды.

Удвоение популяции - удвоение количества клеток при митотическом делении.

Онкогенность - способность ПКК индуцировать превращение клеток в опухолевые (опухоль состоит из клеток хозяина).

Туморогенность - способность ПКК образовывать опухоли при введении чувствительным животным (опухоль состоит из инокулированных клеток).

Пассаж - перенос клеток из одного культурального сосуда в другой для получения необходимого количества клеточной массы при проведении производственного процесса.

Эндогенный вирус - вирус, геном которого интегрируется с геномом данной родительской клетки и наследуется ее потомками.

1. Общие положения.

Получение безопасных и высокоиммуногенных МИБП с использованием диплоидных (ДКК) и гетероплоидных (ГКК) клеточных культур требует применения чувствительных специфических методов контроля их качества на всех этапах производства, начиная от получения субстрата от доноров и заканчивая готовым продуктом.

Процесс производства МИБП на ПКК должен быть валидирован и основан на современной технологии, обеспечивающей высокую степень очистки от клеточных компонентов, контаминирующих агентов, в том числе эндогенных вирусов, клеточной и инфекционной ДНК.

ПКК получают из клеток или тканей, перспективных для производства МИБП и исследуют: на стерильность, жизнеспособность, морфологию и видовую идентичность, онкогенность, туморогенность и контаминацию посторонними агентами.

Для производства МИБП должны использоваться питательные среды, сыворотки, трипсин и другие реактивы, которые зарегистрированы на территории РФ.

Результаты, полученные при изучении посевных (ПКБ) и рабочих (РКБ) клеточных банков, оформляют в форме паспорта и передают для рассмотрения вместе с протоколами исследований и материалами для контроля и аттестации в контролирующие органы.

2. Паспорт перевиваемых клеточных культур

1. Шифр

2. Наименование клеточной культуры

3. Запас клеток (количество ампул, количество клеток в ампуле)

4. Номер пассажа и дата закладки клеток на хранение

5. История получения клеточной культуры и создания клеточного банка

6. Ростовые свойства

7. Видовая идентичность

8. Стерильность

9. Отсутствие посторонних вирусов

10. Эндогенные вирусы

11. Туморогенность

12. Онкогенность

13. Стабильность биологических свойств (количество рекомендованных для производства пассажей)

14. Область применения, чувствительность к производственному штамму вируса (или способность продуцировать биологически активное вещество).

2. Условия работы с перевиваемыми клеточными культурами и требования к персоналу.

Работу с перевиваемыми клеточными культурами проводят в чистых помещениях класса А/В с ламинарным потоком воздуха при соблюдении правил асептики при температуре от 18 до 22°С и относительной влажности от 60% до 70%.

К работе допускается высококвалифицированный подготовленный персонал, соблюдающий правила GMP и владеющий методами пассирования и криоконсервации клеточных культур. Запрещается допускать к работе лиц, которые в тот же день работали с инфекционным материалом или с животными в виварии.

Для профилактики заболеваний персонал обязан регулярно проходить диспансерное наблюдение.

3. Диплоидные клеточные культуры (ДКК)

ДКК получают методом пассирования первичных культур, которые впоследствии становятся перевиваемыми линиями, сохраняющими диплоидный кариотип со структурой, идентичной донору. ДКК растут в богатых витаминами и минеральными солями питательных средах с содержанием значительных количеств сыворотки крови плодов коровы.

Диплоидные клеточные культуры получают из ткани эмбрионов человека от 8 до 20 недель или эмбрионов животных от 1 до 3 мес с помощью общепринятого метода трипсинизации. После формирования клеточного монослоя культуру периодически пассируют один-два раза в неделю.

Диплоидные клеточные культуры должны:

- иметь ограниченный срок жизни;

- иметь стабильный кариотип (2n не менее 75%);

- быть получены из тканей или органов здорового донора, не имеющего в генеалогии онкологических, венерических и генетических заболеваний, врожденных аномалий, заболеваний гепатитами, туберкулезом и вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ);

- не содержать посторонних агентов (бактерий, грибов, простейших, микоплазм, вирусов);

- сохранять стабильность всех биологических свойств в фазе активного роста (первые две трети срока жизни клеточных культур);

- обладать высокой чувствительностью к заражению специфическим агентом.

ДКК проходят следующие фазы развития:

- становления;

- активного роста;

- стационарную;

- старения (дегенерации).

Каждая фаза характеризуется пролиферативной активностью и величиной митотического индекса (МИ). МИ выражают в промилле (_) и вычисляют как отношение числа митотически делящихся клеток к общему числу подсчитанных клеток.

Использование и хранение ДКК должно быть основано на системе клеточных банков различных популяционных уровней удвоения клеток или пассажей. ДКК в отличие от ГКК более требовательны к условиям культивирования, плохо адаптируются к бессывороточным питательным средам, что несколько снижает ценность этого субстрата при крупномасштабном производстве вакцин. Они труднее подвергаются трансфекции и генной инженерии.

4. Гетероплоидные клеточные культуры (ГКК)

ГКК могут быть получены при:

- серийном субкультивировании первично-трипсинизированных клеток опухолей человека или животных;

- трансформации нормальных клеток с ограниченным сроком жизни онкогенным вирусом (например, В-лимфоциты, трансформированные вирусом Эпштейн-Барра);

- серийном субкультивировании первично-трипсинизированных нормальных клеток с выделением доминантной популяции спонтанно трансформированных клеток (например, Vero, ВНК-21, СНО, МDСК);

- слиянии миеломных клеток с В-лимфоцитами, продуцирующими антитела (гибридомы);

Основными преимуществами ГКК являются:

- возможность получения полной характеристики и стандартизации;

- нетребовательность к составу питательной среды;

- возможность адаптации к росту в бессывороточной среде;

- возможность получения больших объемов в биореакторах на микроносителях или в суспензии.

ГКК имеют определенное модальное число хромосом и сохраняют стабильность биологических характеристик в течение установленного срока культивирования.

ГКК могут содержать и экспрессировать эндогенные вирусы, в том числе онкогенные, в связи с чем не исключен теоретический риск онкогенной и инфекционной опасности готового продукта, связанный с остаточной клеточной ДНК и/или трансформирующими белками.

Гетероплоидные клеточные культуры должны:

- иметь неограниченный срок жизни;

- иметь морфологию типичную для данной линии;

- иметь зимограмму и иммунологические маркеры, характерные для донора клеток;

- иметь кариотип, свойственный донору;

- обладать онкогенной и туморогенной безопасностью;

- обладать высокой чувствительностью к заражению специфическим агентом или продуцировать биологически активные вещества;

- сохранять стабильность всех биологических свойств в течение срока, рекомендуемого для производства МИБП.

В ГКК допускается присутствие эндогенных вирусов.

5. Методы испытания перевиваемых (ДКК и ГКК) клеточных культур

При создании клеточных банков должна быть предоставлена информация о доноре, от которого получена клеточная культура, количестве пассажей к моменту создания банка и регламентированных для использования при производстве МИБП, методах и реагентах, применяемых при получении клеточного банка.

Необходимо изучить ростовые свойства клеток, морфологию, способ культивирования, применяемые питательные среды, сроки формирования монослоя, индекс пролиферации, жизнеспособность.

Морфологию клеток изучают при окраске гематоксилин-эозином или азур-эозином.

5.1. Морфология. Получение препаратов для изучения морфологии клеток. Клеточные культуры выращивают в пробирках с покровными стеклами, размером 7х18 мм и толщиной от 0,15 до 0,17 мм при температуре от 36 до 37°С. Посевная доза зависит от вида используемой культуры и применяемой питательной среды.

Морфологию клеток изучают через 48-72 ч после начала культивирования. Препараты фиксируют 96° этиловым спиртом или жидкостью Карнуа в течение 10-15 мин при температуре от 20 до 22°С, окрашивают гематоксилин-эозином или азур-эозином и просматривают в световом микроскопе (окуляр , объектив ). Определяют тип роста клеток (эпителиоподобный или фибробластоподобный), гомогенность цитоплазмы, наличие эозинофильных включений, характерные особенности ядра, ядрышек и др. органелл).

Необходимо описать оптимальные условия и способ культивирования: стационарный, роллерный, суспензионный или псевдосуспензионный, на микроносителях (декстрановых, покрытых коллагеном или желатином, целлюлозных или полистироловых).

Каждая фаза характеризуется пролиферативной активностью и величиной митотического индекса (МИ).

, где:

МИ - митотический индекс;

М - число митотически делящихся клеток;

КL - общее число подсчитанных клеток;

В гетероплоидных клеточных культурах обычно подсчитывают 1-1,5 тыс. клеток, в диплоидных - не менее 2 тыс. в каждом препарате. При определении МИ подсчитывают не менее 5 препаратов.

5.2.Криоконсервация. Определение жизнеспособности клеток.

Основным способом поддержания клеток в жизнеспособном состоянии в течение длительного времени является криоконсервация.

Для криоконсервации клетки ресуспендируют в смеси, состоящей из 80% питательной ростовой среды, 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, 10% глицерина, разливают в ампулы, вместимостью 2,0 или 5,0 мл и замораживают в сосудах Дюара в 96° этиловом спирте с жидким азотом. При замораживании температуру снижают постепенно на 1°С в минуту до минус 25°С, затем до минус 70°С. Клеточные культуры могут храниться при температуре минус 196°С более 10 лет.

Количество клеток определяют в камере Горяева путем подсчета живых и мертвых клеток после окрашивания 0,1% раствором трипанового синего.

Подсчитывают отдельно окрашенные и неокрашенные клетки под окуляром , объективом светового микроскопа. Количество клеток в 1,0 мл исходной суспензии определяют по формуле:

, где:

Х - количество клеток в 1,0 мл исходной суспензии,

а - количество неокрашенных клеток,

2 - коэффициент разведения суспензии,

1000 - коэффициент пересчета для камеры,

0,9 - объем камеры.

Процент жизнеспособных клеток в суспензии определяют по формуле:

, где:

П - процент жизнеспособных клеток;

Х - общее число клеток ;

М - число мертвых клеток

Индекс пролиферации (ИП) определяют по формуле:

, где:

Х - общее число выросших клеток

Y - общее число засеянных клеток.

Общее число засеянных клеток зависит от посевной концентрации, определяют общее число выросших клеток.

5.3.Метод электронной микроскопии.

Метод электронной микроскопии применяют для изучения морфологии клеток и выявления посторонних агентов.

Клеточные культуры выращивают во флаконах вместимостью 100 мл по общепринятой методике.

Через 3-5 сут, когда концентрация клеток будет составлять от до в мл, питательную среду сливают и добавляют от 1 до 2 мл 3% забуференного фиксатора глутарового альдегида.

Через 20-30 мин. фиксатор сливают в центрифужные пробирки, монослой клеток с флакона снимают шпателем, суспендируют в фосфатном буферном растворе с глюкозой по Миллонигу (рН 7,4) (далее буферный раствор по Миллонигу) и сливают в те же центрифужные пробирки. Суспензию клеток центрифугируют при 1500 об/мин от 10 до 15 мин, а надосадочную жидкость удаляют.

Осадок клеток промывают 3 раза по 10 мин буферным раствором Миллонига и дофиксируют в 1% растворе четырехокиси осмия от 1 до 2 ч. при 4°С. Затем материал 3 раза по 10 мин отмывают от осмиевого фиксатора в 30% растворе натрия ацетата, центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин, сливают надосадочную жидкость, а клетки отмывают 2 раза буферным раствором по Миллонигу. Полученный осадок ресуспендируют в дистиллированной воде, суспензию центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин и удаляют пастеровской пипеткой надосадочную жидкость.

Обезвоживание и полимеризация (затвердение):

Материал обезвоживают при температуре от 20 до 22°С в растворах ацетона нарастающей концентрации - 30°, 50°, 80°, 90° по 10-30 мин, затем проводят через две смены 100% ацетона по 30 мин.

Пропитывание и заливка.

После обезвоживания материал проводят через смесь эпоксидных смол эпона и аралдита с катализатором по схеме:

1 ч. заливочной смеси + 3 ч. 100% ацетона - 30 мин

2 ч. заливочной смеси + 2 ч 100% ацетона - 30 мин

3 ч.заливочной смеси + 1 ч. 100% ацетона - 30 мин

Заливочная смесь без ацетона - 60 мин.

Затем кусочки материала извлекают из заливочной смеси, удаляют остатки смолы и помещают в капсулы, заполненные на 2/3 свежей порцией заливочной смеси и помещают в термостат при 37°С на ночь, а затем на 24 ч при температуре 60°С.

Приготовление и двойное окрашивание ультратонких срезов:

Ультратонкие срезы толщиной 1 мкм готовят на ультратоме стеклянными ножами и помещают на сетки-подложки, которые переносят в чашки Петри с 2% водным раствором уранилацетата. Сетки-подложки выдерживают в уранил-ацетате при температуре от 20 до 22°С в течение 10-15 мин.

После окраски уранилацетатом, сетки снимают, промывают сначала дистиллированной водой и высушивают препарат, а затем 0, при температуре от 20 до 22°С. Затем препараты осторожно промывают 0,02% раствором натрия гидроксида и окрашивают раствором свинца в течение 15 мин раствором натрия гидроксида, затем 2 раза дистиллированной водой, высушивают и исследуют под электронным микроскопом.

5.4.Определение видовой идентичности

В процессе работы возможна контаминация одних клеточных культур другими. Основными биохимическими маркерами, специфичными для данного вида донора, позволяющими определить внутривидовую и межвидовую контаминацию клеточных культур являются изоферменты глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФДГ) и лактат-дегидрогеназы (ЛДГ).

У человека и теплокровных известно несколько типов изофермента Г6ФДГ, отличающихся друг от друга по электрофоретической подвижности - быстрый "тип А" и медленный "тип В", а также типы со средней электрофоретической подвижностью.

Для подтверждения вида клеточных культур применяются методы определения спектра изоферментов Г6ФДГ и ЛДГ с помощью вертикального электрофореза в крахмальном и полиакриламидном геле (ГФXII "Электрофорез").

5.5.Определение спектра изоферментов с помощью метода полимеразной цепной реакции. (ПЦР)

Метод основан на выявлении видоспецифических участков митохондриальной ДНК (мтДНК) в области гена, кодирующего субъединицу 1 цитохром с-оксидазы (СОХ1) и цитохрома b (ГФXII "Полимеразная цепная реакция").

Реакция проводится в соответствии с инструкциями по применению тест-систем.

5.6. Метод кариологического анализа хромосом

Метод предназначен для определения стабильности кариотипа ДКК в соответствии с требованиями к кариологическим параметрам; межвидовой идентификации клеток, основанной на сравнении кариотипа опытного образца с нормальным кариотипом известного вида. Совпадение по кариотипу опытного и контрольного образца позволяет заключить, что опытный образец принадлежит данному виду.

Кариологический анализ хромосом проводят на фиксированных препаратах в период митотической активности клеток, используя методы дифференциального окрашивания (С, G и Q) и окраску азур-эозином.

Получение препаратов хромосом. Клетки в концентрации от до в 1,0 мл выращивают в пенициллиновых флаконах с покровными стеклами, при температуре от 36 до 37°С.

Через 36 - 48 ч после посева клеток, в пенициллиновый флакон вносят 0,1 мл 0,04% раствора колхицина из расчета на 1,0 мл питательной среды. Через 1-2 ч питательную среду сливают в сосуд для отходов, к клеткам добавляют 0,25% раствор трипсина и 0,56% раствор калия хлористого, подогретых до температуры от 36 до 37°С и ресуспендируют.

Суспензию клеток выдерживают при температуре от 36 до 37°С в течение 5-7 мин и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в сосуд для отходов, а осадок фиксируют в смеси, состоящей из 1 части метанола и 3 частей уксусной кислоты при температуре от 8 до 10°С в течение 30 мин. Смена фиксатора проводится 2 или 3 раза с промежуточным центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин.

Несколько капель суспензии в фиксаторе наносят на влажные и охлажденные от 8 до 10°С стекла и высушивают в струе теплого воздуха.

Для подсчета модального класса и полиплоидии хромосом клетки окрашивают 1% раствором готового красителя азур-эозина по Романовскому-Гимза.

Дифференциальное окрашивание С-методом применяют для выявления структурного гетерохроматина, локализованного в околоцентрических и центромерных районах хромосом, в коротких плечах акроцентрических аутосом и в длинном плече Y-хромосомы.

Препараты, приготовленные за 1 или 2 сут до опыта, помещают в 0,2% раствор соляной кислоты при комнатной температуре на 30-60 мин, отмывают в дистиллированной воде и помещают в вертикальном положении в свежеприготовленный 5% раствор гидрата окиси бария на 5-15 мин при температуре от 64 до 65°С. Затем препараты последовательно отмывают в 0,2% растворе соляной кислоты и в проточной воде, переносят в чашку Петри со стандартным буферным раствором 2хSSС (далее раствор 2хSSC) и инкубируют при температуре от 64 до 65°С в течение 1,0 - 1,5 ч.

Препараты окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимза в течение 1 ч. Точное время обработки 0,2% раствором соляной кислоты и 5% раствором гидрата окиси бария подбирают эмпирически при каждой фиксации клеточной культуры до получения четких блоков гетерохроматина.

Дифференциальное окрашивание G-методом применяют для идентификации маркерных хромосом.

Через 10 - 30 сут. после приготовления препараты помещают в вертикальном положении на 10 - 90 сек в 0,25% раствор трипсина, подогретый до 30°С, затем в чашку Петри с раствором 2хSSС, инкубируют при температуре от 64 до 65°С в течение 1,0 - 1,5 ч и окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимза в течение 1,0 ч. (Время обработки трипсином подбирают эмпирически для каждой фиксации клеточной культуры до получения четких полос).

Дифференциальное окрашивание Q-методом применяют для идентификации Y - хромосомы и структурных перестроек.

Препараты ополаскивают очищенной водой и окрашивают акрихин-ипритом (дигидрохлоридом). Краситель разводят в растворе 2хSSC до конечной концентрации 50 мкг/мл и наносят на препарат на 10-20 мин. Затем препарат промывают три раза в 3 порциях раствора 2хSSC и заключают под покровное стекло в капле воды с добавлением 20-60% раствора глицерина.

Проведение измерений. Отбор клеток, находящихся в метафазе, для подсчета полиплоидии и выявления аберрации хромосом следует проводить по принципу общей цитологической пригодности при малом увеличении микроскопа (объектив ).

Частоту полиплоидии (2п, 4п и т.д.) в популяции делящихся клеток определяют на основании приблизительного подсчета (объектив микроскопа ). Отбирают метафазные пластинки, отвечающие следующим требованиям:

- все хромосомы должны быть четко окрашены и равномерно расположены;

- в поле зрения не допускается наличие случайных хромосом;

- метафазные пластинки должны иметь округлую форму, большой диаметр не должен превышать двух малых;

- уровень спирализации хромосом должен быть таким, чтобы малые акроцентрические хромосомы были в виде оформленных хромосом, а не в виде точек;

- допускается только поперечное наложение длинных плеч хромосом;

- все хромосомы должны располагаться в одной плоскости.

Точный подсчет хромосом и изучение структурных нарушений проводят с масляной иммерсией (объектив микроскопа ).

интерстициальные делеции (парные округлые образования, диаметр которых не меньше, чем поперечник хроматиды);

- ацентрические кольца (участки хромосом от одного плеча и относятся к группе обменов);

- кольцевые хромосомы (замкнутые структуры, включающие участки большей или меньшей величины из обоих плеч);

- хромосомы, имеющие более одной центромеры (дицентрики, трицентрики и т.д.), являются межхромосомными асимметрическими транслокациями;

- хромосомы не нормальные для данного кариотипа по длине или соотношению плеч (перицентрические инверсии, симметрические межхромосомные транслокации, реципрокные транслокации).

Аберрации хроматидного типа (аберрации одной хроматиды поврежденной хромосомы):

- одиночные ацентрические фрагменты (могут лежать рядом с поврежденной хромосомой или отдельно от нее и представляют собой концевые хроматидные делеции);

- обмен хроматидного происхождения (многообразные формы обмена между хроматидами);

- разрывы по центромере;

- хроматидные и изохроматидные пробелы (гены, бреши, щели), которые представляют собой неокрашенные участки хромосом.

Для получения кариотипа отбирают метафазные пластинки, и фотографируют на фотопленку или цифровую фотокамеру с последующей компьютерной обработкой снимков. Индивидуальные хромосомы вырезают с фотоотпечатков и наклеивают на плотную бумагу (ватман) в порядке убывания или по группам в соответствии с принятой номенклатурой.

5.7.Испытание на стерильность

Контроль на стерильность проводят с применением тиогликолевой среды методом прямого посева или мембранной фильтрации в соответствии с (ГФ ХII "Испытание на стерильность медицинских иммунобиологических препаратов").

5.8.Испытание на присутствие микобактерий птичьего происхождения.

Испытание МИБП на отсутствие микобактерий птичьего вида проводят в том случае, если субстратом производства является культура клеток птичьего происхождения.

Исследуемый материал высевают на среду ЛевенштейнаЇЙенсена. Перед высевом 20,0 мл исследуемого материала центрифугируют в течение 15 мин при 4000 об/мин, затем 19,0 мл надосадочной жидкости удаляют, а осадок ресуспендируют в оставшемся 1,0 мл и высевают по 0,2 мл на 5 пробирок с 6,0 мл среды Левенштейна-Йенсена. Материал культивируют 30 сут при температуре от 38 от 39°С Микобактерии имеют вид S и R-форм колоний различной величины и вида. Некоторые штаммы образуют слабый розовато- желтый пигмент. Культуру клеток считают свободной от микобактерий птичьего вида при отсутствии колоний во всех пяти пробирках. При наличии роста микобактерий хотя бы в одной пробирке материал бракуют.

5.9.Испытание на присутствие микоплазм.

Выявление микоплазм проводят микробиологическим и цитохимическим методами. В качестве дополнительных могут быть применены методы электронной микроскопии (МЭМ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) (ГФ XII).

5.10.Испытание ПКК на присутствие посторонних вирусов

Контроль на присутствие посторонних вирусов проводят на клеточных культурах, лабораторных животных и куриных эмбрионах.

Испытание на клеточных культурах. Исследуют суспензию клеточных культур, объемом 500 мл, содержащую не менее клеток.

Для контроля используют три клеточные культуры:

1) первичные или перевиваемые другой партии, гомологичные по происхождению испытуемым клеткам;

2) диплоидные человеческого происхождения;

3) наиболее чувствительные к видовым вирусам животных-доноров:

Подготовка испытуемой суспензии. Суспензию клеток в концентрации по 100,0 тыс. кл/мл, вносят во флаконы с тремя клеточными культурами, добавляют соответствующую питательную среду (соотношение суспензии и питательной среды 1:5) и 10% сыворотки крови крупного рогатого скота (СКРС).

Флаконы культивируют при температуре от 37 до 38°С 14 сут и регулярно на 2,5, 8,11 и 14 сут просматривают под микроскопом.

При наличии цитопатогенного действия в клеточной культуре материал бракуют.

При отсутствии цитопатогенного действия в клеточной культуре через 14 сут пробы культуральной жидкости проверяют в реакции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами морской свинки, а монослой клеток - в реакции гемадсорбции.

Реакцию гемагглютинации ставят при температуре от 18 до 25°С микрометодом в лунках с круглым дном с использованием 0,5% эритроцитов морской свинки.

Получение эритроцитов. У морских свинок шприцем вместимостью 5,0 мл берут кровь из сердца и отмывают 3 раза до полного осветления 0,9% раствором натрия хлорида с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин. Осадок разводят 0,9% раствором натрия хлорида до 0,5% концентрации.

Проведение реакции гемагглютинации. В лунках агглютинационных пластинок готовят двукратные последовательные разведения исследуемых проб в разведении от 1:2 до 1:128, добавляют к каждому разведению равный объем эритроцитов, смесь перемешивают и инкубируют при температуре от 18 до 20°С до полного оседания эритроцитов.

В лунках с агглютинацией осадок эритроцитов имеет неправильную форму. При отсутствии агглютинации осадок образует компактную точку на дне лунки. При наличии гемагглютинации клеточные культуры не подлежат дальнейшему использованию.

Проведение реакции гемадсорбции. Реакцию гемадсорбции проводят с 0,25% взвесью эритроцитов морской свинки. Приготовление эритроцитов морской свинки описано выше.

Из флаконов с клеточными культурами сливают культуральную жидкость, монослой дважды отмывают раствором Хенкса и вносят взвесь эритроцитов, в объеме достаточном, чтобы покрыть весь монослой, инкубируют 30 мин при температуре от 3 до 5°С, а затем 30 мин при температуре от 20 до 22°С.

Взвесь эритроцитов удаляют из флаконов, монослой отмывают 3 раза раствором Хенкса и исследуют под световым микроскопом (окуляр , объектив ).

Клеточные культуры считаю свободными от посторонних вирусов, если не было выявлено цитопатогенных, гемагглютинирующих и гемадсорбирующих агентов.

Испытание на лабораторных животных. Для контроля используют:

- взрослых беспородных мышей весом от 15,0 до 20,0 г - 20 голов;

- мышей сосунков не старше 24 ч - 20 голов;

- морских свинок весом от 300,0 до 350,0 г - 5 голов;

- кроликов породы шиншилла весом от 2,5 до 3,0 кг - 5 голов.

Клеточные культуры снимают со стекла раствором трипсина или раствором Версена с добавлением химопсина и готовят суспензию клеток в концентрации кл/мл.

Взрослым мышам клеточные культуры вводят внутрибрюшинно и в мозг соответственно по 0,5 и 0,03 мл. За животными наблюдают 28 суток.

Органы животных, заболевших или погибших позднее 24 ч после инокуляции, исследуют макроскопически на наличие патологических признаков. Для выявления патологии внутренних органов готовят 10% суспензии на 0,9% растворе натрия хлорида из головного мозга, печени, почек, селезенки, легких и вводят 5 взрослым мышам по 0,03 мл внутримозговым и по 0,5 мл внутрибрюшинным способом. За животными наблюдают 21 суток.

Мышам-сосункам в возрасте менее 24 ч вводят внутрибрюшинно по 0,1 и 0,01 мл в мозг 10% суспензии клеточных культур и наблюдают за животными 14 сут. Органы заболевших или погибших животных позднее 24 ч после заражения исследуют макроскопически на наличие патологических признаков.

При выявлении патологий внутренних органов готовят 10% суспензии на 0,9% растворе натрия хлорида из головного мозга, печени, почек, селезенки, легких и вводят 5 мышам по 0,03 мл внутримозговым и по 0,5 мл внутрибрюшинным способами. За животными наблюдают 14 суток.

Для определения микобактерий туберкулеза (Micobacterium tuberculosis) проводят контроль на морских свинках. Животным вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл 10% суспензии, приготовленной из клеточных культур и наблюдают за ними в течение 42 суток.

Для определения вируса герпеса обезьян кроликам вводят 10% суспензии, приготовленные из клеточных культур по 0,1 мл внутрикожно и по 2,0 мл подкожно. За животными наблюдают 28 суток.

Клеточные культуры считаются свободными от посторонних вирусов, если на протяжении всего периода наблюдения остаются здоровыми 80% животных в каждой группе. Допускается отход животных до 20% от причин, не связанных с инфекционными заболеваниями.

Контроль на куриных эмбрионах: Клеточные культуры снимают со стекла раствором трипсина или раствором Версена с добавлением химопсина и готовят суспензию клеток в концентрации  кл/мл.

Определение посторонних вирусов проводят на 3-х группах куриных эмбрионов.

Десяти эмбрионам первой группы (9 - 10 сут.) вводят по 0,25 мл суспензии клеток в аллантоисную полость. Эмбрионы инкубируют при температуре от 36 до 37°С в течение 5-6 сут. По истечении указанного срока от каждого эмбриона собирают аллантоисную жидкость, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин и проверяют в реакции гемагглютинации с эритроцитами морской свинки в соответствии.

Десяти эмбрионам второй группы (7 - 8 сут.) суспензию клеток вводят по 0,25 мл в желточный мешок и инкубируют в течение 10 сут при температуре от 36 до 37°С.

Десяти эмбрионам третьей группы (10 - 11 сут.) суспензию клеток вводят по 0,2 мл на хорионаллантоисную оболочку (ХАО) с боковой поверхности яйца через искусственно созданную воздушную полость. Эмбрионы инкубируют в термостате при температуре от 36 до 37°С. Через 5 - 6 сут. каждое яйцо вскрывают и разрезают скорлупу вдоль ножницами на 2 равные части. ХАО извлекают пинцетом, промывают от эритроцитов 0,9% раствором натрия хлорида, помещают в чашки Петри и просматривают при хорошем местном освещении на черном фоне. Если погибло более 2 из 10 эмбрионов, то контроль повторяют на том же количестве эмбрионов другой партии.

Клеточные культуры считаются свободными от посторонних вирусов, если:

- в течение срока наблюдения не менее 80% эмбрионов каждой группы остаются живыми, и ни в одной пробе аллантоисной жидкости не выявлено гемагглютинирующих агентов;

- на хорионаллантоисной оболочке отсутствуют бляшки, узелки и некрозы, видимые невооруженным глазом.

Испытание на эндогенные вирусы

Испытание на эндогенные вирусы проводят электронно-микроскопическим методом, описанном ранее выше, или методом полимеразно-цепной реакции в тест-системах, в соответствии с инструкциями по применению.

Метод ПЦР-ВР предназначен для определения в культуре клеток фермента обратной транскриптазы, характерного для эндогенных ретровирусов.

РНК ретровирусов определяют в неконцентрированной надосадочной культуральной жидкости, полученной при выращивании клеточной культуры в течение от 3 до 6 сут с применением питательной среды RPMI-1640 или Игла-МЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Допускается хранение проб для исследования при температуре минус 80°С.

После размораживания пробирки с пробами встряхивают на микроцентрифуге-вортексе и центрифугируют 5 сек при 5000 об·мин.

В микропробирку типа "Эппендорф" объемом 0,5-1,5 мл последовательно добавляют (в расчете на одну реакцию):

- 10 мкл 2,5х реакционной смеси

- 1 мкл смеси праймеров и зонда MS2

- 1 мкл смеси праймеров и зонда IPC

- 1 мкл плазмиды pTgt2

- 1 мкл РНК бактериофага MS2

Полученную смесь перемешивают на микроцентрифуге-вортексе, центрифугируют 5 сек при 5000 об/мин и вносят по 14 мкл в промаркированные пробирки для ПЦР.

Соответственно маркировке в пробирки вносят по 11 мкл отфильтрованной надосадочной жидкости. В пробирки с отрицательным контролем вносят 11 мкл ДЭПК-Н2О, в пробирки с положительным контролем - 11 мкл и 100 ед MuLV обратной транскриптазы. Перемешивают на микроцентрифугеЇвортексе, осаждают капли с крышки пробирки с помощью кратковременного центрифугирования.

Помещают пробирки в прибор и проводят реакцию согласно инструкции по эксплуатации прибора АНК-16, АНК-32, АНК-64:

- используют программу "АНК.exe";

- выбирают режим работы "Циклический";

- в окне "Циклический" вводят параметры температурно-временного режима амплификации согласно инструкции;

- в пробы вносят красители (ROX и R6G) и вводят сведения об образцах по соответствующему красителю;

- проводят 11 циклов амплификации, отключают режим "Реальные" и активируют окно приема сигнала флуоресценции по второму и третьему измерительным каналам (наличие положительной динамики в какой либо лунке свидетельствует о наличии в реакционной смеси специфических фрагментов кДНК возбудителя и позволяет дать предварительное положительное заключение о наличии активности обратной транскриптазы в соответствующем образце);

- после завершения работы программы нажимают кнопку "Просмотр" и фиксируют результаты работы прибора;

- проводят обработку результатов работы прибора.

Учёт результатов анализа (табл. 1)

Таблица 1
Учёт результатов анализа

Результат			Значение
Проба	ВПК	ПКО
ДА	Любое	ДА	В образце присутствует активность обратной транскриптазы
НЕТ	ДА	ДА	В образце присутствует активность обратной транскриптазы
НЕТ	НЕТ	любое	Ложноотрицательный Результат

Результаты анализа не подлежат учету:

- в случае регистрации прибором ОКО (ложноположительный результат);

- в случае отсутствия регистрации сигнала прибором по обеим каналам детекции (ложноотрицательный результат);

- в случае отсутствия регистрации прибором ПКО (ложноотрицательный результат).

Результаты анализа подлежат учету:

- в случае отсутствия регистрации прибором ОКО;

- в случае регистрации прибором ВПК-В;

- в случае регистрации прибором ПКО.

Испытание на туморогенность. Для оценки туморогенной активности клеток используются две биологические системы: "ин виво" или "ин витро". Испытанию подлежат клетки из посевного и рабочего клеточных банков, субкультивированные в системе ин витро в течение не менее трех пассажей, превышающих рекомендованные для производства МИБП.

В системе "ин виво" используют иммуносупрессированных животных, или имеющих генетическую иммунную недостаточность (например, бестимусные мыши с мутацией по гену nude, мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИ) или с супрессией функции Т-клеток антитимоцитарным глобулином (АТГ), антитимоцитарной (АТС) или антилимфоцитарной (АЛС) сыворотками.

Наиболее подходящей моделью для выявления туморогенности клеток являются новорожденные или взрослые мыши nude, позволяющей получать достоверные и стандартные результаты.

В системе "ин витро" применяют метод инвазивности в органные культуры.

Изучение туморогенности на бестимусных голых мышах.

Взрослым бестимусным мышам (не менее 30 голов) с мутацией по гену nude (генотип nu/nu) самкам линии Balb/c весом от 19,0 до 20,0 г подкожно или внутримышечно вводят по 1,0 млн исследуемой клеточной культуры. Контрольной группе животных (30 голов) вводят по 1,0 млн заведомо туморогенных клеток линии HeLa. Животных содержат в специализированном кондиционированном виварии в соответствии с требованиями GLP. За животными опытной и контрольной групп наблюдают 21 сут. Существуют рекомендации о наблюдении за животными в около 4 мес. В течение периода наблюдения ежедневно обследуют животных путем щадящей пальпации места инокуляции клеток и лимфатических узлов (регионарных аксиллярных и подколенных). Оценивают общее состояние мышей, фиксируют гибель животных, связанную с наличием иммунодефицита, появление опухолевого роста. Образовавшиеся узлы измеряют штангенциркулем и вычисляют объем по формуле:

, где:

а - длина,

в - ширина,

с - высота опухоли.

Вычисляют среднее значение показателя .

После окончания срока наблюдения проводят эвтаназию животных и при макроскопическом исследовании определяют наличие узлов в месте введения клеток, в лимфатических узлах, легких, почках, печени и селезенке. Все поражения, напоминающие опухоли, а также лимфатические узлы и органы всех животных исследуют гистологически.

Если изучаемые клетки являются заведомо туморогенными, следует определить уровень их туморогенности, основанный на расчете значения 50%-ной туморопродуцирующей дозы ().

Для расчета изучаемые клетки вводят экспериментальным животным в дозах и и данные выражают как 50% доза опухолеобразования .

Изучение туморогенности в системе in vitro методом инвазивности в органные культуры

Метод основан на внесении испытуемых клеток в органную культуру кожи куриного эмбриона. Он чувствительный, достаточно простой и не требует длительного времени для выполнения.

Этапы воспроизведения методики. Приготовление куриного эмбрионального экстракта

Для приготовления эмбрионального экстракта 10 куриных 7 сут эмбрионов устанавливают в штатив воздушной полостью вверх, скорлупу протирают спиртом и прожигают. Ножницами удаляют часть скорлупы над воздушной полостью, подскорлупную оболочку и вынимают эмбрионы.

Куриные эмбрионы отмывают в чашке Петри 2-3 раза от эритроцитов питательной средой 199 или 0,9% раствором натрия хлорида, помещают в шприц, вместимостью 20,0 - 25,0 мл и продавливают ткань в центрифужные пробирки, заполняя их не более чем наполовину.

В каждую пробирку добавляют равный объем раствора Эрла, закрывают пробками и тщательно перемешивают.

Материал помещают в холодильник при температуре от 4 до 6°С. Через 24 ч центрифугируют при 1500 - 2000 об/мин в течение 10 мин, отбирают надосадочную жидкость, разливают во флаконы и хранят при температуре минус 20°С не более 6 мес.

Приготовление агара и среды.

В колбу, вместимостью 500 мл вносят 1,0 г агара Дифко, 100 мл раствора Эрла и 20 mМ HEPES.

Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой и помещают в водяную баню при 100°С на 30 мин.

Смешивают 4,0 мл куриного эмбрионального экстракта, 4,0 мл сыворотки крови плодов коровы и 10 мл 1% агара, остуженного до температуры от 40 до 50°С. К смеси добавляют бензилпенициллина натриевую соль в концентрации 100 мг/мл, разливают пипеткой от 1,0 до 1,5 мл в лунки пластиковой панели, закрывают крышкой и оставляют при температуре 20 - 22°С до затвердения среды.

Получение фрагментов куриного эмбриона. Извлекают 9-сут куриные эмбрионы, декапитируют их и помещают эмбрион спинкой вверх в чашку Петри с питательной средой 199.

Придерживая эмбрион пинцетом в области шеи, острыми ножницами делают круговой разрез кожи спинки диаметром от 5,0 до 7,0 мм и закругленной частью браншей изогнутого пинцета сдвигают вырезанный лоскут кожи от шейной части в направлении к хвостовой. Захватив край фрагмента кожи пинцетом, натягивают его на плоскую часть глазной палочки эпидермисом (более матовой поверхностью) вниз, переносят в лунку с агаром и расправляют с помощью двух пинцетов. Закрывают панель крышкой.

Приготовление суспензии испытуемых клеточных культур. Испытуемые клеточные культуры снимают общепринятым методом со стекла трипсином, ресуспендируют в питательной среде 199, подсчитывают в камере Горяева и разводят до концентрации кл/мл.

На поверхность трех кожных фрагментов наносят по 1,0 мл клеточной суспензии в виде капли. Таким же образом на 2-3 кожных фрагмента наносят суспензию клеток HeLa (положительный контроль). Оставляют 2-3 контрольных неинокулированных фрагмента кожи.

Пластиковую панель закрывают крышкой и инкубируют в атмосфере при температуре от 36 до 37°С.

Приготовление гистологических препаратов. Через 72 ч инкубации фрагменты кожи снимают с поверхности агара и помещают в фиксирующую смесь на 24 - 72 ч и промывают в 70° 3 - 4 раза. Затем материал обезвоживают и заливают в парафин по общепринятой методике. Готовят по 3 гистологических препарата, толщиной 5 - 7 микрон и окрашивают гематоксилин-эозином.

Опыт учитывают, если:

а) в контрольных фрагментах кожи не отмечено признаков деструкции органной культуры;

б) в положительном контроле имеются признаки, указывающие на наличие туморогенных свойств клеточной культуры;

Основным критерием туморогенности клеточных культур является инвазия испытуемых клеток в органные культуры кожи куриного эмбриона, т.е. проникновение и распространение пролиферирующих клеток в собственно дерму.

Клетки испытуемых клеточных культур рассматривают как туморогенные, если хотя бы в одном из образцов органной культуры наблюдается инвазивный рост.

Испытание на онкогенность. Онкогенная активность клеточного субстрата может быть обусловлена клеточной ДНК или онкогенными компонентами, присутствующими в клетке (вирусная ДНК, РНК или трансформирующие белки).

На наличие онкогенности исследуют заведомо туморогенные клетки, субкультивированные в системе in vitro в течение не менее трех пассажей, превышающих рекомендованные для производства МИБП.

Изучение онкогенности проводят в системе in vivo, вводя экспериментальным животным клеточную ДНК и клеточный лизат в сравнительных опытах с положительным контролем.

Испытание проводят на :

- новорожденных бестимусных мышах (генотип Nu/Nu) не старше 24 ч;

- новорожденных крысах или хомяках (не старше 24 ч );

- новорожденных мышах линии NIH Swiss.

Для снижения риска потенциальной опасности остаточной ДНК необходимо:

- контролировать количество гетерогенной ДНК в препаратах, вводимых парентерально методом ПЦР

- Количество ДНК в одной человеческой дозе МИБП должно составлять не более 10,0 нг;

- для инактивированных препаратов необходимо проводить валидацию методов инактивации и очистки, обеспечивающих снижение количества и дефрагментацию гетерогенной ДНК в МИБП;

- в препаратах, вводимых перорально, количество гетерогенной ДНК не определяют. Однако при разработке такого продукта следует учитывать особенности производственного процесса с целью уменьшения количества остаточной клеточной ДНК.

Испытание сыворотки крупного рогатого скота. Испытание сыворотки на присутствие посторонних вирусов предусматривает использование первично-трипсинизированных и перевиваемых культур клеток. Продолжительность контроля 28 сут.

При выполнении контроля используют два вида культур клеток: первично-трипсинизированные культуры клеток - тестикулы эмбрионов быка (ТБ) 4-6 месячного возраста и перевиваемые клетки почки бычка (МDBК) или любые другие перевиваемые культуры клеток почки крупного рогатого скота, в которые вносят исследуемые сыворотки. Принцип метода основан на появлении цитопатического действия (ЦПД) или гемадсорбции под действием вирусов-контаминантов.

Отбирают по 1 флакону c клеточными культурами ТБ и МDВК и по 1 контрольному флакону вместимостью 800 мл (225 ). Во флаконы с клеточными культурами ТБ и МDВК вносят по 25 мл испытуемой сыворотки. В контрольные флаконы вносят по 25 мл сыворотки, ранее отконтролированной на присутствие посторонних вирусов и микоплазм. Клеточные культуры инкубируют при температуре °С. Через мин сыворотку из опытных и контрольных флаконов сливают, добавляют по 75 мл среды ДМЕМ и инкубируют в термостате при температуре °С 14 сут. Периодически на 2,5, 7,10 и 14 сут опытные и контрольные клеточные культуры просматривают под микроскопом. Если за время наблюдения ни в опытных, ни в контрольных клеточных культурах не будет наблюдаться цитопатических изменений, через 14 сут их трижды замораживают при температуре минус °С и размораживают при °С. После размораживания отбирают из опытных флаконов с культурами клеток по 25 мл суспензии, вносят во флаконы с клетками того же вида, 2 флакона с культурами клеток ТБ и МDВК оставляют в качестве контрольных и инкубируют в термостате при температуре °С в течение 14 сут. Если в течение 14 сут в опытных и контрольных клеточных культурах не наблюдается цитопатических изменений, их проверяют на наличие гемадсорбирующих вирусов. С этой целью из опытных и контрольных флаконов сливают питательную среду, вносят по 50 мл 0,25% взвеси куриных эритроцитов, эритроцитов морской свинки и человека группы 1(0) и инкубируют при температуре °С. Через 30-35 мин эритроциты из флаконов удаляют, а монослой клеток промывают раствором Хенкса или любой питательной средой и просматривают под микроскопом при увеличении . Если в клеточных культурах при первичной инокуляции сыворотки и в пассаже не наблюдается цитопатических изменений и гемадсорбции, сыворотка считается пригодной. Если в опытных флаконах отмечаются цитопатические изменения или гемадсорбция при отсутствии их в контрольных, сыворотку бракуют. Если цитопатические изменения или гемадсорбция наблюдаются в опытных и контрольных флаконах, допускается однократный переконтроль сыворотки.

Испытание трипсина, приготовленного из поджелудочной железы свиней. Трипсин, полученный из поджелудочной железы свиней, используют для диспергирования тканей при приготовлении первичных и перевиваемых клеточных культур. Трипсин должен быть проверен на присутствие бактерий, грибов, микоплазм и вирусов. Испытание трипсина на стерильность и присутствие микоплазм проводят с помощью методов, изложенных выше при описании контроля сыворотки крови крупного рогатого скота. Для выявления вирусов используют тестикулы свиней или клетки Vero. Клетки инкубируют в течение 14 сут (первый пассаж) с дополнительной инкубацией в течение 14 сут (второй пассаж) для наблюдения цитопатических изменений в культуре и феномена гемадсорбции.

В качестве дополнительных методов для выявления вирусов (свиного парвовируса 1, свиных цирковирусов 1 и 2 типов, аденовирусов, гастроэнтеритов, энцефалита свиней и др. возможно использование ИФА и ПЦР

Для инактивации потенциальных вирусов-контаминантов возможно использовать gamma-облучение. Если используется облучение, дозы должны быть достаточно низкими и не изменять биологические свойства облучаемых материалов.