Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина жёлтой лихорадки живая сухая, лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина жёлтой лихорадки живая сухая, лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения"

Вводится впервые

Данная фармакопейная статья распространяется на Вакцину жёлтой лихорадки живую сухая, лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения.

Вакцина жёлтой лихорадки живая, представляет собой лиофилизированный препарат, полученный на основе тонкоизмельченной ткани куриных эмбрионов, свободных от специфической патогенной микрофлоры (specific pathogen free - SPF), зараженных аттенуированным вирусом желтой лихорадки, штамм "17Д", очищенный центрифугированием.

Вакцину восстанавливают непосредственно перед применением, как указано на этикетке ампулы и в Инструкции по применению на препарат.

Вакцина не содержит консервантов и антибиотиков.

Производство

Одна доза вакцины содержит: Активный компонент - Вирус желтой лихорадки, штамм "17Д" - или 1600 БОЕ вируса, может содержать вспомогательные вещества (содержание расчетное) предусмотренные частной фармакопейной статьей.

Для приготовления вакцины (производственного штамма, первичного и вторичного посевных серий вируса) применяется культивирование вируса в развивающихся куриных эмбрионах, свободных от специфической патогенной флоры (SPF).

Куриные эмбрионы должны быть получены из Сертифицированных хозяйств.

Технология производства, производственные помещения, оборудование, реагенты и растворы, подготовка персонала должны соответствовать требованиям GMP.

В соответствии с требованиями ВОЗ, должна строго выполняться система посевных серий, должно быть строгое ограничение количества пассажей вируса в процессе приготовления вакцины (не более 2 пассажей от первичного посевного материала).

Для получения готовой лекарственной формы вакцины перед лиофилизацией в препарат добавляют (содержание расчётное) вспомогательные вещества, повышающие стабильность вакцины (стабилизаторы) при хранении и транспортировании в течение срока годности. Вспомогательные вещества поступают на производство с сертификатами качества и контролируются в соответствии с требованиями, предъявляемым к ним НД. Названия и количество вспомогательных веществ (стабилизаторов) указывается в частной фармакопейной статье.

В состав препарата не должны вноситься в качестве стабилизатора альбумин человека или сыворотка крови человека.

Испытание готового продукта

Описание. Пористая масса светло-розового цвета, гигроскопична.

Испытание проводят визуально.

Подлинность. Аттенуированный вирус жёлтой лихорадки, штамм "17Д", должен нейтрализоваться специфической иммунной сывороткой к штамму "Дакар" вируса жёлтой лихорадки. Индекс нейтрализации не менее 1,0 lg.

Определение проводят биологическим методом в реакции нейтрализации (РН) в одной из культур клеток:

- первично-трипсинизированные фибробласты эмбрионов кур (ФЭК);

- перевиваемой культуре клеток почек эмбрионов свиньи (PS);

- перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (VERO);

или в биологической РН на мышах линий BALB/С или СВА 4 - 6 недельного возраста массой 10 - 12 г.

Постановка РН в культурах клеток.

Приготовление смеси вирус вакцины + специфическая иммунная сыворотка.

Используют 2 ампулы вакцины. Содержимое ампул разводят в растворителе - вода для инъекций, содержащем 2% сыворотки крови плодов коровы, жидкой, инактивированной при температуре от 55 до 57°С в течение 30 мин, проверенной на отсутствие ингибиторов к вирусу желтой лихорадки. Используют 0,5 мл растворителя на одну дозу вакцины. Восстановленную вакцину выдерживают при температуре от 18 до 25°С в течение 15 - 20 мин. Затем содержимое двух ампул объединяют и готовят последовательные разведения вакцины 1:5 и 1:50 в растворе натрия хлорида 0,9%, содержащем 2% сыворотки крови коров, жидкой, инактивированной при температуре от 55 до 57°С в течение 30 мин, проверенной на отсутствие ингибиторов к вирусу жёлтой лихорадки. Каждое разведение вакцины в объёме 1,0 мл смешивают с равным объёмом рабочего разведения иммунной кроличьей сыворотки к штамму "Дакар" вируса желтой лихорадки и не иммунной кроличьей сыворотки, получая, таким образом, конечные разведения вакцины 1:10 и 1:100.

Иммунная кроличья сыворотка к штамму "Дакар" вируса желтой лихорадки в рабочем разведении должна нейтрализовать 100 - 300 БОЕ в 0,1 мл вируса желтой лихорадки, штамм "17Д". В РН необходимо использовать то же разведение не иммунной кроличьей сыворотки, что и иммунной.

Смесь вирус-сыворотка выдерживают при температуре от 36 до 38°С в течение 1 ч.

Постановка реакции нейтрализации (РН).

Используют одну из указанных выше (п. 3.2.) культур клеток.

- взвесь клеток ФЭК, в объёме 20 мл, содержащую 200 - 300 тыс. клеток в 1,0 мл, вносят во флаконы ёмкостью 100 мл и выращивают при температуре от 35 до 37°С в течение 1 -2 сут до образования полностью сформированного монослоя или

- взвесь клеток PS с конечной концентрацией 100 - 200 тыс. клеток в 1,0 мл в питательной культуральной среде L-15, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы, жидкой, вносят в 6-ти луночные полистироловые стерильные планшеты для культуры клеток по 3.0 мл в лунку, или в 12-ти луночные планшеты по 1,5 мл в лунку и выращивают при температуре от 35 до 37°С в течение 2 - 3 сут до образования полностью сформированного монослоя или взвесь клеток линии VERO с конечной концентрацией клеток 100 - 200 тыс. в 1,0 мл в питательной культуральной среде Игла МЕМ, содержащей 5% сыворотки крови коров, жидкой вносят в 6-ти луночные полистироловые стерильные планшеты для культуры клеток по 3,0 мл в лунку и выращивают при температуре от 35 до 37°С в течение 2 - 3 сут до образования полностью сформированного монослоя.

Перед внесением на монослой культуры клеток смеси вирус-сыворотка, ростовую среду сливают и монослой промывают один раз раствором Эрла. Смесь вирус-сыворотка вносят в объёме 0,2 мл в каждые 3 флакона с ФЭК или в каждые 3 лунки планшетов с клетками PS или VERO.

Флаконы с ФЭК или планшеты с PS или VERO помещают в термостат при температуре от 35 до 37°С на 2 ч., периодически обкатывают монослой клеток смесью вирус - сыворотка путем покачивания флаконов или планшетов через каждые 15 - 20 мин.

После адсорбции вируса во флаконы или лунки планшетов на клеточный монослой наносят питательный агар.

Состав агарового покрытия для культуры ФЭК:

Раствор А:

     - питательная среда 199 (10-кратный концентрат)      - 10,0 мл

     - раствор Хенкса (10-кратный концентрат)              - 10,0 мл

     - вода для инъекций                                   - 57,0 мл

     - сыворотка крови плодов коровы, жидкая, инактивированная

      при температуре от 55 до 57°С в течение 30 мин,

      проверенная на отсутствие ингибиторов к вирусу

      желтой лихорадки                                     - 10,0 мл

     - раствор натрия бикарбоната 7,5%                     - 8,0 мл

     - куриный эмбриональный экстракт                      - 5,0 мл

     - стрептомицина сульфат                               - 50,0 мкг/мл

Раствор А подогревают на водяной бане до температуры от 35 до 37°С.

Раствор Б:

     - агар фирмы "Difco" или "Fluka"                    - 2,5 - 3,0 г

     - вода для инъекций                                 - до 100,0 мл.

Раствор Б стерилизуют в кипящей водяной бане в течение 3 ч, затем

оставляют при температуре от 18 до 25°С для охлаждения до температуры от 35 до 37 °С.

Растворы А и Б смешивают в стерильной колбе. Смесь должна быть жидкой. В каждый флакон с культурой ФЭК пипеткой вносят по 10,0 мл смеси. Флаконы оставляют при температуре от 18 до 25°С до застывания агара, затем их переворачивают клеточным монослоем вверх и выдерживают в термостате при температуре от 35 до 37°С в течение 4 сут.

После инкубации на агаровое покрытие в каждый флакон вносят второе агаровое покрытие в объёме 5,0 мл.

Состав второго агарового покрытия для культуры ФЭК:

     - агар фирмы "Difco" или "Fluka" - 2,5                  - 3,0 г

     - вода для инъекций                                     - до 100,0 мл

     - 10% раствор нейтрального красного фирмы "Serva" или

      "Sigma" в разведении 1 : 1000                          - 10,0 мл.

2.5 - 3,0% раствор агара стерилизуют в кипящей водяной бане в течение 3 ч, затем охлаждают при температуре от 18 до 25°С до температуры агара от 35 до 37°С . К 90,0 мл агара добавляют 10,0 мл разведенного (1:1000) раствора нейтрального красного. После нанесения второго агарового покрытия флаконы оставляют при температуре от 18 до 25°С до застывания агара, затем их переворачивают клеточным монослоем вверх и выдерживают в термостате при температуре от 35 до 37°С в течение 1 сут.

Состав агарового покрытия для перевиваемых клеток PS:

Раствор А:

     - питательная среда L-15 фирмы "Sigma"                       - 15,0 мл

     - раствор Эрла (10-кратный)                                  - 0,5 мл

     - сыворотка крови плодов коровы, жидкая, инактивированная

       при температуре от 55 до 57°С в течение 30 мин, проверенная

       на отсутствие ингибиторов к вирусу желтой лихорадки        - 0,6 мл

     - 4% раствор гентамицина сульфата для инъекций               - 20,0 мл.

Раствор А подогревают на водяной бане до температуры от 35 до 37 °С.

Раствор Б:

     - агар фирмы "Difco"                                     - 0,1 г

     - вода для инъекций                                      - 3,8 мл

Раствор Б стерилизуют в кипящей водяной бане в течение 1 ч и оставляют при температуре от 18 до 25°С для охлаждения до температуры от 35 до 37°С .

Растворы А и Б смешивают в стерильной колбе (смесь должна быть жидкой). В каждую лунку планшета с культурой PS пипеткой вносят по 1,5 мл смеси в 12- луночные планшеты или по 3,0 мл смеси в 6-луночные планшеты. Планшеты оставляют при температуре от 18 до 25°С до застывания агара, затем ставят в термостат и выдерживают в атмосфере 5% двуокиси углерода с течение 5 сут при температуре от 35 до 37 °С.

После инкубации на агаровое покрытие наслаивают 10% раствор трихлоруксусной кислоты по 1,0 мл на 1 лунку и выдерживают планшеты в течение 1 ч при температуре от 35 до 37 °С, после фиксации клеток монослоя кислотой агаровое покрытие путём встряхивания планшета удаляют, монослой промывают проточной водой, подсушивают и окрашивают карболовым фуксином. Через 3 мин после внесения красителя планшеты промывают проточной водой и подсушивают на воздухе при температуре от 18 до 25°С .

Состав агарового покрытия для клеток VERO:

Раствор А:

     - питательная среда Игла МЕМ жидкая                   - 21,2 мл

     - раствор Эрла (10-кратный)                           - 2,2 мл

     - 4% раствор для инъекций гентамицина сульфата        - 30,0 мкл

     - сыворотка крови плодов коровы, жидкая,

      инактивированная при температуре от 55 до 57°С

      в течение 30 мин, проверенная на отсутствие

      ингибиторов к вирусу желтой лихорадки                - 0,9 мл

Раствор А подогревают на водяной бане до температуры от 35 до 37°С.

Раствор Б:

     - агар фирмы "Difco"                                  - 0,15 г

     - вода для инъекций                                   - 5,7 мл.

Раствор Б стерилизуют в кипящей водяной бане в течение 1 ч, затем оставляют при температуре от 18 до 25 С для охлаждения до температуры от 35 до 37°С .

Растворы А и Б смешивают в стерильной колбе. Смесь должна быть жидкой. В каждую лунку планшета с культурой клеток VERO пипеткой вносят по 3,0 мл смеси. Планшеты оставляют при температуре от 18 до 25°С до застывания агара, затем ставят в термостат и выдерживают в газовой среде с 5% двуокисью углерода в течение 6 - 7 сут при температуре от 35 до 37°С .

После инкубации на агаровое покрытие наслаивают 10% раствор трихлоруксусной кислоты по 1,0 мл на лунку и выдерживают планшеты в течение 1 ч при температуре от 35 до 37 °С. После фиксации клеток монослоя трихлоруксусной кислотой агаровое покрытие удаляют путем встряхивания планшета, монослой промывают проточной водой, подсушивают и окрашивают карболовым фуксином. Через 3 мин после внесения красителя планшеты промывают проточной водой и подсушивают на воздухе при температуре от 18 до 25°С .

Учёт результатов

Учёт результатов проводят на 5 сут при титровании в культуре клеток ФЭК или PS, или на 6 - 7 сут при титровании вируса в культуре клеток VERO. Подсчитывают количество бляшек отдельно в каждой лунке или флаконе. Затем вычисляют среднее количество бляшек из 3 лунок планшета или 3 флаконов, соответственно для каждого разведения вируса. Титр вируса с иммунной и не иммунной сыворотками подсчитывают, как описано в разделе "Специфическая активность" и выражают в десятичных логарифмах БОЕ.

Индекс нейтрализации (подлинность вируса желтой лихорадки) представляет собой разницу lg титров вируса с не иммунной сывороткой и иммунной сывороткой и должен быть не менее 1,0 lg.

Постановка реакции биологической нейтрализации (рбн) на мышах линий BALB/С или СВА массой 10 - 12 г, возрастной категории 4 - 6 недель.

Приготовление смеси вирус - сыворотка.

Используют 2 ампулы вакцины. Содержимое ампул с вакциной растворяют в растворителе (вода для инъекций), содержащем 2% сыворотки крови плодов коровы, жидкой, инактивированной при температуре от 55 до 57°С в течение 30 мин, проверенной на отсутствие ингибиторов к вирусу желтой лихорадки, из расчёта по 0,5 мл растворителя на одну дозу вакцины.

Материал выдерживают при температуре от 18 до 25°С в течение 15 - 20 мин. Затем содержимое 2-х ампул объединяют и готовят последовательные разведения вакцины: 1:5; 1:50; 1:500; 1:5000 в 0,9% растворе натрия хлорида, содержащем 2% сыворотки крови плодов коровы, жидкой, инактивированной при температуре от 55 до 57°С в течение 30 мин, проверенной на отсутствие ингибиторов к вирусу желтой лихорадки. По 1,0 мл каждого разведения вакцины смешивают с равным объёмом иммунной кроличьей сыворотки к штамму "Дакар" вируса желтой лихорадки или с равным объёмом не иммунной кроличьей сыворотки, получая таким образом соответствующие конечные разведения вакцины 1:10; 1:100; 1:1000; и 1: 10000.

Полученные смеси выдерживают при температуре от 36 до 38°С в течение 1 ч, затем каждое разведение вируса с иммунной или не иммунной сыворотками вводят в объёме 0,03 мл в мозг не менее, чем 6 мышам линий BALB/С или СВА 4 - 6 недельного возраста, массой 10 - 12 г.

За животными наблюдают в течение 21 сут и регистрируют все случаи их гибели. Специфическую гибель животных учитывают, начиная с 5 сут после заражения. Титр вируса в ЛД50 подсчитывают по методу Рида и Менча.

Индекс нейтрализации должен быть не менее 1,0 lg представляющий собой разницу lg титров вируса с не иммунной и иммунной сыворотками.

Время растворения. Не более 5 мин при добавлении 0,5 мл растворителя (вода для инъекций) на одну дозу вакцины. Определение проводят визуально по методике указанной в частной фармакопейной статье.

Цветность. Восстановленная вакцина - жидкость желтовато-розового цвета. Определение проводят визуально по ОФС "Степень окраски жидкостей"

Прозрачность. Восстановленная вакцина - опалесцирующая жидкость желтовато-розового цвета.

- не более 0,6 ед. оптической плотности. Определение проводят колориметрически при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 3 мм.

Механические включения. Должны отсутствовать. Определение проводят в соответствии с ОФС "Видимые механические включения в парентеральных лекарственных формах и глазных лекарственных формах"

Потеря в массе при высушивании. Не более 2,5%. Определение проводят весовым методом в соответствии с ОФС "Определение потери в массе при высушивании".

Белковый азот. Не более 0,25 мг/доза. Определение проводят колориметрическим методом с реактивом Несслера в соответствии с ОФС "Определение белкового азота с реактивом Несслера с предварительным осаждением белкового материала".

Овальбумин. Не более 5,0 мкг/доза. Определение проводят методом ИФА по методике, указанной в частной фармакопейной статье.

Стерильность. Должна быть стерильной. Определение проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации по ОФС "Стерильность".

Присутствие микоплазм. Не должна содержать микоплазм. Определение проводят микробиологическим методом по методике указанной в частной фармакопейной статье.

Бактериальные эндотоксины. Не более 5 ЕЭ/доза. Определение проводят методом гель-тромб тест в соответствии с ОФС: "Бактериальные эндотоксины".

Аномальная токсичность. Должна быть нетоксична. Определение проводят в соответствии с ОФС: "Аномальная токсичность". Тест-доза: морским свинкам - 1 доза вакцины подкожно, белым мышам по 1дозе вакцины внутрибрюшинно.

Специфическая активность. Должна содержать в одной дозе не менее 1000 ЛД50 или 1600 БОЕ вируса. Определение проводят биологическим методом.

Определяют титр вируса в одной из ниже указанных культур клеток:

- первично-трипсинизированных фибробластах эмбрионов кур (ФЭК);

- перевиваемой культуре клеток почек эмбрионов свиньи (PS);

- перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (VERO) или

на мышах BALB/С или СВА 4 - 6 недельного возраста, массой 10 - 12 г.

Для всех видов титрования используют по 3 ампулы вакцины отдельно. Содержимое каждой ампулы растворяют в растворителе (вода для инъекций), содержащем 2% сыворотки крови плодов коровы, жидкой, инактивированной при температуре от 55 до 57°С в течение 30 мин, проверенной на отсутствие ингибиторов к вирусу желтой лихорадки. Используют по 0,5 мл растворителя на одну прививочную дозу. Восстановленную вакцину выдерживают при температуре от 18 до 25°С в течение 15 - 20 мин. Затем проводят титрование одним из вышеуказанных методов (раздел "Подлинность").

При каждом испытании специфической активности вакцины параллельно проводят титрование стандартного образца вакцины желтой лихорадки, откалиброванного по Международному стандарту вакцины желтой лихорадки.

Определение специфической активности (титр в БОЕ) вакцины при титровании вируса методом бляшек в культурах клеток ФЭК, PS,VERO.

Готовят последовательные разведения вакцины: 1:10; 1:100; 1:000; 1:10000 в 0,9% растворе натрия хлорида с 2% раствором сыворотки крови плодов коровы, жидкой, инактивированной при температуре от 55 до 57°С в течение 30 мин и проверенной на отсутствие ингибиторов к вирусу желтой лихорадки. Каждое разведение в объёме 0,1 мл вносят в три флакона вместимостью 100,0 мл с полностью сформировавшимся монослоем клеток ФЭК, или в три лунки 6-ти или 12-ти луночных планшетов с полностью сформировавшимся монослоем культур клеток PS или VERO.

Инфицированные клетки во флаконах или планшетах помещают на 2ч в термостат при температуре от 36 до 38°С . Через каждые 15 -20 мин проводят обкатывание монослоя клеток вируссодержащей жидкостью путем покачивания флаконов или планшетов. По истечении периода адсорбции вируса в каждый флакон (планшет) наносят агаровое покрытие и инкубируют (раздел "Подлинность").

Учет результатов.

Учёт результатов (определение титра вируса желтой лихорадки) проводят на 5 сут при титровании в культурах клеток ФЭК или PS, и на 6 - 7 сут при титровании в культуре клеток VERO.

Подсчитывают количество бляшек отдельно в каждом флаконе (лунке), после чего определяют среднее количество бляшек из 3 флаконов или из 3 лунок соответственно для каждого разведения вируса и определяют концентрацию вируса в одной прививочной дозе вакцины (0,5 мл). Титр вируса (А) выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ/0,5 мл) и вычисляют по формуле:

, где

X - среднее количество бляшек из 3 флаконов или 3 лунок;

Y - разведение вакцины, мл;

0,1 - объём инокулята, внесенного в один флакон или одну лунку, мл;

0,5 - объём одной дозы вакцины, мл.

Примечание; при вычислении титра вируса учитывают все разведения вакцины со средним числом бляшек от 1 до 30 в одном флаконе или в одной лунке.

Определение специфической активности вакцины методом титрования вируса на мышах линий BALB/С или СВА.

Мышам линий BALB/С или СВА 4 - 6 недельного возраста, массой 10 - 12 г, вводят в мозг вирус вакцины в дозе 0,03 мл в разведениях 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000. Разведения готовят в 0,9% растворе натрия хлорида с 2% раствором сыворотки крови плодов коровы, жидкой, инактивированной при температуре от 55 до 57°С в течение 30 мин, проверенной на отсутствие

ингибиторов вируса желтой лихорадки. На каждое разведение вакцины используют не менее 6 животных. Разведения вакцины вводят в мозг мышам сразу после их приготовления. За животными наблюдают в течение 21 сут, регистрируют все случаи заболевания или гибели животных, начиная с 5 сут после инокуляции. Мышей, у которых паралич наступил на 21 сут наблюдения, считают выжившими.

Титр вируса вакцины вычисляют по методу Рида и Менча и выражают в  мл.

Во всех случаях определения "Специфической активности" вакцины ЖЛ параллельно проводят титрование ОСО вакцины желтой лихорадки.

Термостабильность. Титр вируса вакцины после прогревания при температуре от 36 до 38 °С в течение 2 недель не должен снижаться более, чем на 1.0 lg и должен быть не менее 1000 ЛД50 или 1600 БОЕ в одной дозе.

Для испытания используется не менее 6 ампул вакцины от каждой испытуемой серии. 3 ампулы хранят при температуре от 2 до 8°С в течение 2 недель, 3 ампулы подвергают воздействию температуры от 36 до 38°С в течение 2 недель. Затем проводят одновременное определение титра вируса во всех 6 ампулах в одной из культур клеток ФЭК, PS, VERO по методике, изложенной в разделе "Специфическая активность". Разница титра вакцины не прогретой и титра вакцины прогретой составляет показатель термостабильности препарата.

Производственный штамм. Аттенуированный штамм "17Д" вируса желтой лихорадки.

Первичная посевная серия N 213/77 в лиофилизированной форме получена из референс-лаборатории ВОЗ. Условия хранения при температуре минус 70°С .

Вторичная посевная серия (рабочий посевной вирус) приготовлена из первичной посевной серии и представляет собой лиофилизированную суспензию тонкоизмельчённой ткани куриных эмбрионов, которые должны быть SPF (свободными от специфической патогенной микрофлоры). Вторичную посевную серию производственного штамма получают в условиях одного производственного цикла, т.е. однократного пассирования первичной посевной серии вируса.

Вторичная посевная серия штамма "17Д" применяется непосредственно для получения вакцины и должна быть аттестована и должна соответствовать следующим требованиям:

- быть стерильной (не содержать бактерий, грибов);

- не содержать микоплазм, микобактерий туберкулеза и посторонних вирусных агентов;

- обладать специфической активностью, определяемой в одной из культур клеток: первично-трипсинизированных фибробластах эмбрионов кур (ФЭК), или перевиваемых линиях клеток - PS (клетки почек эмбриона свиньи), или VERO (клетки почек зеленой мартышки); или на мышах линии BALB/С или СВА 4 - 6 недельного возраста, массой 10 - 12 г.

Титр вируса должен быть не менее 10000 ЛД50/мл или 16000 БОЕ/мл;

- должна быть подлинной, т.е. нейтрализоваться специфической иммунной сывороткой к вирулентному штамму "Дакар" вируса желтой лихорадки с индексом нейтрализации не менее 1,0 lg;

- должна быть специфически безопасной при заражении обезьян Macaca mulatta (rhesus monkeys) или Macaca fascicularis (cynomolgus monkeys) или другого вида обезьян чувствительного к вирусу желтой лихорадки. Обезьяны не должны иметь в крови вируснейтрализующих антител к вирусу желтой лихорадки до введения посевного вируса.

Нейротропные, висцеротропные и иммуногенные свойства вторичного посевного вируса контролируют на группе не менее чем 10 обезьян. Параллельно на таком же количестве обезьян проводят испытания первичной посевной серии вакцинного вируса, которая в данном случае используется в качестве препарата сравнения.

Испытуемая доза, содержащая не менее, чем 5000 (8000 БОЕ) и не более, чем 50000 (80000 БОЕ), вводится во фронтальную долю мозга каждой обезьяне под анестезией. Обезьяны после заражения должны наблюдаться в течение 30 сут.

Нейровирулентность вторичной посевной серии вируса считается удовлетворительной при отсутствии статистически достоверных отличий в гистологической оценке изменений, вызванных у обезьян после введения в мозг вторичной посевной серии вируса, по сравнению с аналогичными показателями изменений вызванных первичной посевной серией вируса.

Вторичная посевная серия вируса штамма "17Д" должна быть висцеротропной (вызывать вирусемию). Выявление вируса проводят в сыворотках обезьян на 2, 4 и 6 сутки после заражения по методике, применяемой для теста "Специфическая активность".

Содержание вируса в 0,03 мл сыворотки обезьяны должно быть не менее 100 (160 БОЕ) и не более 500 (800 БОЕ).

Вторичная посевная серия вируса штамм "17Д" должна быть иммуногенна для обезьян, т.е. вызывать образование вируснейтрализующих антител к штамму "17Д" вируса желтой лихорадки не менее, чем у 90% обезьян в течение 30 сут после введения испытуемой дозы. Наличие вируснейтрализующих антител в сыворотках крови подопытных обезьян устанавливают в реакции нейтрализации вируса желтой лихорадки в культурах клеток по методу указанному в разделе "Подлинность"

Вторичная посевная серия должна быть не токсичной для мышей и морских свинок раздел "Аномальная токсичность".

При параллельном испытании препарата сравнения - первичной посевной серии должны быть получены аналогичные результаты.

Упаковка и Маркировка. Определение проводят в соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".

Дополнительная информация: На внешней упаковке (пачке с ампулами вакцины) указывают: "Стерильно", "Препарат не содержит консервантов и антибиотиков", "Хранить в недоступном для детей месте", "Для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических учреждений", "Для культивирования вируса используются куриные эмбрионы SPF - категории".

Транспортирование. При температуре от 2 до 8°С.

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".