Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади Иммуноглобулин антирабический"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади
Иммуноглобулин антирабический"

Вводится впервые

Данная фармакопейная статья распространяется на иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади, предназначенный в комбинации с вакциной антирабической для профилактики бешенства по экстренным показаниям.

Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади (гетерологичный иммуноглобулин антирабический), раствор для инъекций, представляет собой полученную риванол-спиртовым методом белковую гамма-глобулиновую фракцию сыворотки крови лошадей, гипериммуннизированных вирусом бешенства. Для иммунизации животных-продуцентов используют производственный штамм фиксированного вируса бешенства "Москва".

Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади выпускают в комплекте с иммуноглобулином антирабическим разведенным 1:100, предназначенным для проведения внутрикожной пробы с целью выявления гиперчувствительности к белкам сыворотки крови лошади.

Производственный штамм вируса бешенства

Производственный штамм фиксированного вируса бешенства "Москва" должен соответствовать следующим требованиям:

Подлинность. Должен нейтрализоваться иммуноглобулином антирабическим из сыворотки крови лошади и не должен нейтрализоваться нормальной сывороткой крови крупного рогатого скота. Индекс нейтрализации должен быть не менее 100.

Для испытания параллельно готовят два ряда разведений вируса в диапазоне 1:5-1:50000 с кратностью разведения 10. В качестве среды разведения используют 2% раствор нормальной лошадиной сыворотки, приготовленный с применением стерильной воды очищенной или воды для инъекций. Сыворотку лошадиную нормальную предварительно инактивируют при температуре 56°С в течение 30 мин. Для получения разведений в первую пробирку каждого ряда, соответствующую разведению 1:5, вносят 0,4 мл среды разведения, в остальные пробирки ряда по 0,45 мл среды разведения. В первую пробирку каждого ряда добавляют по 0,1 мл восстановленной суспензии вируса бешенства штамм "Москва" и тщательно перемешивают содержимое пробирок. Далее готовят ряд последовательных разведений путем переноса 0,05 мл смеси из предыдущей в следующую пробирку, каждый раз используя новую пипетку. Из последней пробирки, соответствующей разведению 1:50000, удаляют 0,05 мл смеси. В результате, конечный объем содержимого каждой пробирки составляет 0,45 мл смеси.

В каждую пробирку первого ряда вносят по 0,45 мл иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади жидкого, в каждую пробирку второго ряда вносят по 0,45 мл нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота, инактивированной при температуре 56° в течение 30 мин.

В результате получают 2 ряда разведений вируса бешенства штамм "Москва" от до . Содержимое пробирок осторожно перемешивают путем встряхивания и инкубируют при температуре °С в течение мин. Затем пробирки охлаждают на льду до комнатной температуры и каждым разведением вируса бешенства в объеме 0,03 мл заражают по 6 беспородных мышей массой 9-10 г интрацеребрально. За животными наблюдают 14 дней. Мышей, павших в течение первых четырех дней, при расчетах не учитывают. Титр вируса, использованного для заражения каждой из двух групп мышей, вычисляют по методу Рида и Менча. Индекс нейтрализации рассчитывают путем вычитания логарифма обратного разведения, соответствующего вируса в смеси с иммуноглобулином антирабическим из сыворотки крови лошади жидким, из логарифма обратного разведения, соответствующего вируса в смеси с нормальной сывороткой крупного рогатого скота. Если полученная разница превышает 2, то индекс нейтрализации больше 100.

Стерильность. Не должен содержать бактерий, в том числе микобактерий туберкулеза, грибов; микоплазмы должны отсутствовать. Определение проводят на тиогликолевой среде в соответствии с ОФС "Стерильность".

Посторонние вирусные агенты. Не должен содержать посторонних вирусных агентов по результатам испытания на мышах-сосунках, испытания на беспородных белых мышах с массой тела 15-20 г, испытания на морских свинках с массой тела 350-500 г, испытания на культурах клеток.

Инфекционный титр вируса. Не менее при интрацеребральном заражении беспородных белых мышей с массой тела 9-10 г, не более при внутримышечном и подкожном путях заражения; не менее  мл при интрацеребральном заражении кроликов породы "Шиншилла" с массой тела 2,5-3,0 кг.

При необходимости пассирования исходного производственного штамма для приготовления антигена для гипериммунизации животных-продуцентов допускается проведение не более 3 пассажей через мозг кролика. Полученный антиген должен быть стерильный.

Животные-продуценты

Для иммунизации используют клинически здоровых лошадей без различия пола. При отборе животных-продуцентов не допускается использовать лошадей, прошедших ранее курс гипериммунизации против любых вирусных инфекций. Для производства иммуноглобулина используют сыворотки лошадей с титром не ниже 1:500 в реакции нейтрализации на белых мышах с разрешающей дозой вируса 100-500  мл.

Выделение балластных белков и получение осадка гамма-глобулина

Выделение балластных белков и получение осадка гамма-глобулина проводят риванол-спиртовым методом.

Вспомогательные вещества

В состав препарата должны входить вспомогательные компоненты, разрешенные к медицинскому применению в дозах не вызывающих токсические, аллергические или иные нежелательные реакции у человека. В качества стабилизатора используют глицин.

Наименование вспомогательных веществ, используемых в производстве, указывают в частной фармакопейной статье.

Испытания промежуточных продуктов

На производстве

Сыворотка, полученная от гипериммунизированных животных:

рН - от 7,5 до 7,7. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Надосадочная жидкость после этапа выделения балластных белков:

Полнота осаждения риванола: риванол должен отсутствовать. Определение проводят методом флюоресценции (см. раздел "Испытания готового препарата").

Фильтрат для выделения гамма-глобулина:

рН - от 6,8 до 7,2. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Жидкий иммуноглобулин:

Белок - от 9 до 11%. Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС "Белок".

Этап розлива и запайки:

По показателю "Герметичность" испытывают все ампулы серии. Для проведения испытания ампулы помещают в кассеты, заполненные водой, подкрашенной любым водно-растворимым красителем. Кассеты погружают таким образом, чтобы ампулы полностью находились в воде. Емкость герметично закрывают и создают в ней избыточное, по сравнению с атмосферным, давление -  кПа. Давление выдерживают в течение 20-25 мин, после чего устанавливают в емкости давление, равное атмосферному. Емкость открывают, кассеты с ампулами вынимают и просматривают на наличие в них подкрашенной воды. Ампулы, содержащие подкрашенную воду, считают не выдержавшими испытание.

Испытания готового препарата

Описание. Прозрачная или слабо опалесцирующая жидкость от бесцветной до слабо-желтой окраски. Не допускается розовое окрашивание. Определяют визуально.

Подлинность. Испытание проводят с использованием двух методик.

1. Видоспецифичность. Должен обладать видовой специфичностью, свойственной только белкам сыворотки крови лошади. Определение проводят методом кольцепреципитации c использованием коммерческих сывороток, преципитирующих белки сыворотки крови лошади, белки сыворотки крови человека, белки сыворотки крупного рогатого скота, сыворотки крови свиньи.

Испытуемый образец разводят 0,9% раствором натрия хлорида в соотношении 1:1000. В 4 стеклянные пробирки с высотой 6-10 мм вносят по 0,4 мл разведенного образца, затем на дно пробирок путем подслаивания под образец медленно вносят по 0,1 мл преципитирующей сыворотки: в первую пробирку - сыворотку, преципитирующую белки сыворотки крови лошади, во вторую пробирку - сыворотку, преципитирующую белки сыворотки крови человека, в третью пробирку - сыворотку, преципитирующую белки сыворотки крови крупного рогатого скота, в четвертую пробирку - сыворотку, преципитирующую белки сыворотки крови свиньи. Учет результатов проводят невооруженным глазом при дневном освещении на черном фоне при температуре от 16 до 24°С немедленно и по истечении 1 ч. Образец считают выдержавшим испытание, если в первой пробирке (с гомологичной сывороткой) образуется кольцо преципитации в течение от 1 до 10 мин и если во второй, третьей, четвертой пробирках (с гетерологичными сыворотками) не образуется кольцо преципитации в течение 1 ч.

2. Специфичность антител. Должен содержать антитела к вирусу бешенства. Определение проводят по разделу "Специфическая активность".

Прозрачность. Не более 0,05. Определение проводят спектрофотометрическим методом. В кювету с толщиной слоя 3 мм помещают испытуемый образец и измеряют оптическую плотность при длине волны 540 нм по сравнению с водой очищенной.

Цветность. Не более 0,15. Определение проводят спектрофотометрическим методом. В кювету с толщиной слоя 3 мм помещают испытуемый образец и измеряют оптическую плотность при длине волны 400 нм по сравнению с водой очищенной.

рН. От 6,6 до 7,4. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Механические включения. Видимые механические включения должны отсутствовать. Определение проводят в соответствии с ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

Белок. От 9 до 11%. Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС "Белок".

Электрофоретическая однородность. Содержание фракции gamma - глобулинов должно быть не менее 80%, фракций alpha,beta - глобулинов - не более 20%, фракция альбумина должна отсутствовать. Определение проводят методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы в соответствии с ОФС "Определение однородности сывороточных препаратов методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы"".

Риванол. Должен отсутствовать. В одну кварцевую кювету толщиной слоя 10 мм вносят препарат иммуноглобулина, в другую - стандартный раствор риванола. Кюветы помещают в источник УФ-лучей. Препарат визуально сравнивают со стандартным раствором, содержащим 0,2 мкг/мл риванола. В иммуноглобулине должна отсутствовать характерная для риванола желто-зеленая флюоресценция.

Приготовление основного раствора риванола100 мкг/мл.

5 мг риванола помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор готовят перед использованием.

Примечание

Приготовление стандартного раствора риванола 0,2 мкг/мл.

Раствор готовят в два этапа:

1. Приготовление раствора риванола 2 мкг/мл. 1 мл основного раствора риванола помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор готовят перед использованием.

2. К 0,5 мл полученного раствора, добавляют 4,5 мл воды очищенной и перемешивают. Раствор готовят перед использованием.

Спирт этиловый. Не более 4,5%. Определение проводят методом дистилляции в соответствии с требованиями ОФС "Определение спирта этилового в жидких фармацевтических препаратах".

Стерильность. Должен быть стерильным. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации с использованием тиогликолевой среды в соответствии с ОФС "Стерильность".

Пирогенность. Должен быть апирогенным. Определение проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность". Препарат вводят из расчета 1,0 мл на 1 кг массы тела кролика.

Аномальная токсичность. Должен быть нетоксичным. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность", раздел "Вакцины и сыворотки".

Препарат вводят внутрибрюшинно 5 белым мышам с массой тела 17-20 г по 1,0 мл, подкожно 2 морским свинкам с массой тела 250-300 г - по 5 мл в каждый бок. За животными наблюдают 7 дней

Специфическая активность. Не менее 150 МЕ/мл. Испытание проводят биологическим методом на мышах линии Balb/c или беспородных белых мышах с массой тела   г.

Специфическую активность испытуемого образца определяют в сравнении с ОСО специфической активности иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади, калиброванным по отношению к международному стандарту специфической активности иммуноглобулина антирабического.

Предварительно испытуемый и стандартный образцы разводят 0,9% раствором натрия хлорида для инфузий до получения конечного разведения (после добавления разрешающего разведения фиксированного вируса бешенства штамм "CVS") в соотношении 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000 и т.д. в зависимости от предполагаемой специфической активности испытуемого образца. Разрешающее разведение вируса бешенства, содержащее от 100 до 500 в 0,03 мл, в объеме, равном объему испытуемого образца и стандартного образца, добавляют в каждую пробирку. Содержимое пробирок перемешивают путем встряхивания. Расчет разрешающего разведения вируса бешенства для испытания проводят на основании результатов предварительного титрования вируса бешенства (определения инфекционного титра вируса).

Для определения точного количества доз вируса бешенства, взятого в опыт, одновременно с разведениями испытуемого образца, готовят разведения вируса бешенства. Приготовленное разрешающее разведение вируса бешенства смешивают с 2% раствором нормальной лошадиной сыворотки, приготовленном с применением стерильной воды очищенной или воды для инъекций, в соотношении 1:1. Полученную смесь условно принимают за разведение и готовят её десятикратные разведения на 2% растворе нормальной лошадиной сыворотки, приготовленном с применением стерильной воды очищенной или воды для инъекций. Сыворотку лошадиную нормальную предварительно инактивируют при температуре 56°С в течение 30 мин.

Пробирки с разведениями испытуемого образца, стандартного образца и фиксированного вируса бешенства штамм "CVS" инкубируют при температуре 37°С в течение мин или при температуре °С в течение ч. Затем пробы вводят лабораторным животным в объеме 0,03 мл интрацеребрально из расчета не менее 10 мышей на каждое разведение испытуемого образца и стандартного образца и не менее 10 мышей на каждое разведение фиксированного вируса бешенства штамм "CVS".

За мышами наблюдают в течение 14 сут. При оценке результатов опыта учитывают мышей, заболевших или павших с 5 по 14 сут. При расчете специфической активности по методу Рида и Менча следует учитывать, что количество животных в группах, получивших разные разведения иммуноглобулина, на 5 сут должно быть одинаковым (допускается неспецифическая гибель в первые 4 сут после заражения не более одной мыши в группе).

После окончания опыта вычисляют точное количество вируса, содержащееся в 0,03 мл разрешающего разведения, по методу Рида и Менча.

Расчет специфической активности антирабического иммуноглобулина производят по следующим формулам:

1) Определяют защитный титр (Т) (разведение, при котором выжило 50% экспериментальных животных) испытуемого образца и стандартного образца

,

где:

А - логарифм обратной величины разведения, при котором смертность животных ниже 50%;

В - показатель смертности ниже 50%;

С - показатель смертности выше 50%;

Д - логарифм кратности разведения.

2) Специфическую активность испытуемого иммуноглобулина (У) определяют в МЕ в 1 мл относительно специфической активности стандартного образца по формуле:

где: - обратная величина защитного титра испытуемого иммуноглобулина;

- обратная величина защитного титра стандартного образца;

n - специфическая активность стандартного образца в МЕ.

В случае, если при проведении испытания специфическая активность иммуноглобулина нормативных требований, допускается проведение повторного испытания. Если по результатам повторного испытания специфическая активность менее нормативных требований, то испытание прекращают, а иммуноглобулин считают не выдержавшим испытания. Если по результатам повторного испытания, специфическая активность соответствует нормативным требованиям, необходимо проведение еще одного испытания. Если по результатам третьего испытания, специфическая активность ниже нормативных требований, иммуноглобулин считают не выдержавшим испытания; если специфическая активность соответствует нормативным требованиям, иммуноглобулин считают выдержавшим испытания.

Производственный штамм.

Аттенуированный штамм фиксированного вируса бешенства "Москва".

Иммуноглобулин антирабический разведенный 1:100

Описание. Прозрачная бесцветная жидкость. Определяют визуально.

Прозрачность. Не более 0,05. Определение проводят спектрофотометрическим методом. В кювету с толщиной слоя 3 мм помещают испытуемый образец и измеряют оптическую плотность при длине волны 540 нм по сравнению с водой очищенной.

Цветность. Не более 0,15. Определение проводят спектрофотометрическим методом. В кювету с толщиной слоя 3 мм помещают испытуемый образец и измеряют оптическую плотность при длине волны 400 нм по сравнению с водой очищенной.

рН. От 6,6 до 7,4. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Белок. От 0,015 до 0,115%. Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС "Белок".

Стерильность. Должен быть стерильным. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации с использованием тиогликолевой среды в соответствии с ОФС "Стерильность".

Упаковка и Маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".

Указывают вид животного, из крови которого получают препарат.

Транспортирование. При температуре от 2 до 8°С.

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".