Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина чумная живая, таблетки для рассасывания"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина чумная живая, таблетки для рассасывания"

Вводится впервые

Вакцина чумная живая, таблетки для рассасывания представляет собой лиофилизированную живую культуру вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV линии НИИЭГ. Вакцина предназначена для профилактики чумы и вызывает развитие специфического иммунитета длительностью до одного года.

Особенности производства

Вакцинный штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ должен обладать типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами; содержать плазмиды pFra, пестициногенности (pPst) и кальцийзависимости (pCad) с молекулярными массами 60 , и MD соответственно; не должен вызывать гибели морских свинок и потери их массы при введении им дозы микробных клеток (м.к.). Иммуногенность штамма по величине ЕD50 при подкожном введении не должна превышать для морских свинок  м.к., для белых мышей -  м.к. Перед приготовлением очередной серии вакцинного штамма Y. pestis EV проводят его пассаж через организм морской свинки с последующим отбором типичных колоний, выросших на чашках Петри из посевов селезенки или регионарных лимфатических узлов. Вакцинный штамм хранится в ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России.

Технология изготовления вакцины предусматривает получение посевных культур Y. pestis EV I, II и III генерации, процесса накопления биомассы, необходимой для приготовления микробной взвеси определенной концентрации, последующий розлив, сублимационное высушивание, приготовление гранулята, приготовление таблетированной вакцины, фасовку и упаковку препарата.

В зависимости от технологии приготовления вакцины в процессе производства используются вспомогательные вещества разрешенные для медицинского применения: лактоза, тиомочевина, декстрин, аскорбиновая кислота.

На стадиях приготовления посевных культур определяют рН, концентрацию микробных клеток и отсутствие посторонней микрофлоры.

Испытание готового продукта

Описание. Таблетка светло-коричневого цвета правильной круглой формы с цельными краями, ровной и плоской поверхностью. Имеет запах какао, ванилина и ментола. Определение проводят визуально.

Подлинность. Должна содержать чистую культуру вакцинного штамма чумного микроба. Определение проводят иммунофлуоресцентным методом. Таблетку ресуспендируют в 49 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Из полученной суспензии готовят три мазка, которые окрашивают иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими чумными и просматривают под фазовоконтрастным и люминесцентным микроскопами не менее 50 полей зрения в каждом. Обнаруживаемые под фазовым контрастом микробные клетки должны быть окрашены иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими чумными. Допускается наличие не более 1 неокрашенной микробной клетки в 50 полях зрения.

Распадаемость. Таблетка должна распадаться в течение 15 мин. Определение проводят в соответствии с ОФС "Распадаемость таблеток и капсул".

Средняя масса. От 0,6 до 1,0 г. Определение проводят в соответствии с ОФС "Однородность массы дозированных лекарственных форм".

рН растворенного препарата. От 6,8 до 7,4 Таблетку растворяют в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Определение проводят потенциометрически в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Потеря в массе при высушивании. Не более 10%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании". На каждый из двух параллельных анализов используют навеску из 3 измельченных таблеток.

Микробиологическая чистота. Таблетка может содержать не более микробных клеток (м.к.) бактерий непатогенных микроорганизмов.

Таблетку берут стерильным пинцетом, помещают во флакон вместимостью 100 мл, содержащим 49 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Флакон закрывают стерильной пробкой, устанавливают на платформу шуттель-аппарата и тщательно перемешивают до полного растворения таблетки.

По 0,5 мл засевают на 5 чашек Петри с агаром Хоттингера рН . Посевы инкубируют при температуре ()°С в течение 5 сут, после чего подсчитывают число выросших колоний.

Количество живых микробных клеток непатогенных микроорганизмов рассчитывают по формуле:

,

где:

N - количество микробных клеток посторонних микроорганизмов в таблетке;

- суммарное количество колоний, выросших на чашках Петри;

49 - объем 0,9% раствора натрия хлорида, использованного для ресуспендирования таблетки, мл;

m - количество чашек Петри, использованных для посева;

0,5 - объем суспензии, высеваемой на 1 чашку, мл.

При обнаружении хотя бы в одной таблетке более живых м.к. испытание повторяют на удвоенном количестве таблеток. Если при повторном испытании число посторонних микроорганизмов в таблетке превышает  м.к., препарат считают не выдержавшим испытание.

Специфическая безопасность. Вакцина должна быть специфически безопасной. Испытание проводят на морской свинке массой  г. Таблетку ресуспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида, доводят до концентрации  м.к./мл по ОСО мутности 42-28-85П (10 МЕ) соответствующего года выпуска, эквивалентного  м.к./мл чумного микроба и вводят подкожно 1 мл одной морской свинке в область внутренней поверхности бедра.

На 6-е сутки морскую свинку взвешивают, подвергают эвтаназии, отмечают патологоанатомические изменения, обнаруживаемые при вскрытии. Печень, селезенку, легкие, регионарные лимфатические узлы, кровь и ткани из места введения засевают методом отпечатков на чашку Петри с агаром Хоттингера рН с добавлением натрия сернистокислого в концентрации 0,25 г на 1 л среды, и чашку Петри с агаром Хоттингера рН с добавлением генцианвиолета в концентрации 0,05 г на 1 л среды. Посевы инкубируют при температуре °С в течение 3 сут.

Вакцина не должна вызывать у морской свинки потери массы к 6 сут после введения больше, чем на 20%, не должна вызывать видимых патологоанатомических изменений в легких - кровоизлияний, очагов воспаления, гранулем, абсцессов; в посевах крови и легких не должно быть роста чумного микроба. В месте введения допускается развитие кровоизлияния и инфильтрата подкожной клетчатки, переходящих в некроз. Во внутренних органах (селезенка и печень) допустимо развитие ограниченной узелковой реакции.

Специфическая активность.

1. Содержание живых микробных клеток. Таблетка должна содержать от до живых микробных клеток вакцинного штамма Y. pestis EV.

При определении содержания живых микробных клеток в вакцине используют концевые химически чистые пипетки, пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида должны быть охлаждены до температуры °С.

Таблетку ресуспендируют в 49 мл 0,9% раствора натрия хлорида. После тщательного перемешивания полученную взвесь вакцины разводят в 0,9% растворе натрия хлорида последовательно десятикратно от до , пипеткой вместимостью 5 мл, используя для каждого разведения отдельную пипетку. Из разведения высевают по 0,1 мл на 5 чашек Петри с агаром Хоттингера с добавлением стимулятора роста (кровь гемолизированная или натрий сернистокислый). Посевы инкубируют в течение 3 сут при температуре ()°С, затем подсчитывают общее количество колоний на 5 чашках Петри. Количество живых микробных клеток в таблетке рассчитывают по формуле:

,

где:

N - количество живых микробных клеток в таблетке;

- суммарное количество колоний, выросших на чашках;

- степень разведения;

49 - объем 0,9% раствора натрия хлорида, использованного для ресуспендирования таблетки, мл;

m - количество чашек Петри, используемых для посева.

2. Иммуногенность. для морских свинок не должна превышать , для белых мышей - живых микробных клеток.

Испытания проводят на морских свинках массой () г и на белых нелинейных мышах массой () г. 3 таблетки вакцины чумной живой ресуспендируют стерильно в 0,9% растворе натрия хлорида. Объем растворителя определяют, исходя из заранее определенного количества живых клеток в таблетке, с таким расчетом, чтобы 1 мл ресуспендированного препарата содержал живых м.к. Для иммунизации морских свинок вакцину доводят до концентраций  м.к./мл,  м.к./мл,  м.к./мл и  м.к./мл; для иммунизации белых мышей - до концентраций  м.к./мл,  м.к./мл,  м.к./мл и  м.к./мл. Каждую дозу вводят 6 животным. Морских свинок иммунизируют подкожно в объеме 0,5 мл; белых мышей - в объеме 0,2 мл дозами и  м. к. во внутреннюю поверхность левого бедра.

Подкожное заражение морских свинок проводят во внутреннюю поверхность правого бедра на 21-е сут, мышей - в ту же область на 7-е сут или 21-е сут после иммунизации. Заражающая доза для иммунизированных вакциной животных составляет 200 DСL (Dosis certa letalis = LD100) вирулентного штамма чумного микроба, 1 DСL которого не должна превышать 100 микробных клеток.

Подготовка заражающего штамма Y. pestis 231 описана в частной фармакопейной статье предприятия.

Для заражения неиммунных (контрольных) животных используют взвесь концентрацией 50 м.к./мл в объеме 0,5 мл для морских свинок и 125 м.к./мл в объеме 0,2 мл для белых мышей, что соответствует 1 Dcl.

Для определения фактического содержания микробных клеток заражающего штамма по 0,1 мл взвеси культуры Y. pestis 231 содержащей  м.к./мл высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера и равномерно распределяют по всей поверхности среды методом "обкатки" чашек. Посевы инкубируют при температуре °С в течение 48 ч, после чего подсчитывают количество выросших колоний.

Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 20 сут. Все контрольные животные должны погибнуть от чумы в течение 10 сут. Погибших животных вскрывают, органы и ткани (у морских свинок берут пробы из места введения, регионарного пахового лимфатического узла, печени, селезенки, легкого, верхушки сердца; у белых мышей - из селезенки), высевая их методом отпечатков на чашки Петри с агаром Хоттингера с генцианвиолетом и агаром Хоттингера с натрием сернистокислым. Чашки Петри инкубируют при температуре °С. Учет результатов проводят через 24-48 ч.

Павшими от чумы считают только тех животных, из органов которых при высеве выделяется культура Y. pestis.

вычисляют по формуле:

где:

S - логарифм кратности разведений;

- логарифм максимальной иммунизирующей (фактической) дозы;

- отношение числа животных, выживших при иммунизации данной дозой, к общему числу, которым эта доза была введена;

- сумма значений , найденных для всех испытанных доз.

Если все контрольные животные не погибнут или значение будет более допустимого, контроль повторяют на таком же количестве животных. Если при повторном испытании значение будет более допустимого, препарат считают не выдержавшим испытание.

Маркировка и упаковка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".