Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС "Безопасность пробиотиков в тестах in vivo"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС
"Безопасность пробиотиков в тестах in vivo"

Вводится впервые

Настоящая статья распространяется на методы определения безопасности пробиотических производственных штаммов и пробиотиков для медицинского применения*.

Для определения безопасности испытуемого препарата используют биологические методы in vivo. Биологическими методами in vivo определяют следующие показатели:

1. Безвредность (раздел 1);

2. Вирулентность (раздел 2);

3. Токсичность (раздел 3);

4. Токсигенность (раздел 4);

Общая часть

Требования к безопасности испытуемого препарата касаются подтверждения безвредности и отсутствия токсичности, токсигенности и вирулентности. Испытания на безопасность позволяют выявлять недопустимые реакции лекарственного средства на организм человека и подтверждают отсутствие риска причинения вреда здоровью в результате его применения.

Контроль испытуемого препарата по показателю "Безвредность" является обязательным при отборе и хранении производственных штаммов, отработке новых технологий производства лекарственного средства, при предварительном и сертификационном контроле, при оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности. Целью проведения теста на безвредность является выявление негативного воздействия испытуемого препарата на организм животного, появляющееся при образовании токсических примесей (например, при нарушении производственного регламента, нарушениях условий хранения и т.п.).

Показатели "Вирулентность", "Токсичность" и "Токсигенность" являются обязательными при контроле безопасности производственных штаммов бактерий рода Escherichia coli, Bacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Propionibacterium, Aerococcus, Enterococcus, дрожжевых грибов - Saccharomyces сerevisiae, S.boulardii и др. микроорганизмов (разделы 2, 3 и 4). Целью проведения тестов на вирулентность, токсичность и токсигенность является выявление возможной патогенности испытуемых штаммов, превышающей установленный ранее допустимый уровень, что может контролироваться по летальности или интоксикации животных.

Раздел 1. Определение безвредности

Испытание безвредности испытуемого препарата осуществляют при пероральном введении беспородным белым мышам одной человеческой дозы испытуемого препарата*(2).

Пробоподготовка

Испытуемый препарат растворяют или разводят, в случае необходимости, раствором натрия хлорида 0,9% для инъекций, подогретого до 37°С (если в частной фармакопейной статье даны иные указания по растворителю, то следуют им).

1. Приготовление испытуемого производственного штамма:

Восстановление производственного штамма (из лиофилизированного состояния или со среды хранения) проводят с использованием адекватных питательных сред и в адекватных условиях, принятых для определенной таксономической группы микроорганизмов в соответствии с ОФС "Производственные штаммы и штаммы для контроля". Для испытания используют культуру второго или третьего пассажа, которую инкубируют на адекватной плотной питательной среде в адекватных условиях. Выросшую культуру, с поверхности плотной питательной среды, смывают 0,9% раствором натрия хлорида. Смыв (суспензию) собирают в стерильную посуду (флакон, пробирку и т.д.). В полученной суспензии, используя стандартный образец мутности 10 ЕД ОСО 42-28-85 или международный стандарт мутности (The International Reference Preparation of Opacity of 10 International Units)*(3), определяют концентрацию микробных клеток в оптических единицах (ОЕ). Затем суспензию бактерий разводят 0,9% раствором натрия хлорида, получая тест-дозы - в концентрации ОЕ в объеме 0,5 мл или не более 1,0 мл (если в частной фармакопейной статье даны иные указания по определению тест-дозы, то следуют им).

2. Приготовление испытуемого препарата (методом случайной выборки отбирают не менее 5-6 образцов от каждой серии препарата, если в частной фармакопейной статье даны иные указания):

- лиофилизат во флаконе: содержимое флакона ресуспензируют в 0,9% растворе натрия хлорида, подогретого до 37°С, из расчета 0,5 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз;

- порошки: содержимое 2 пакетов разводят в 5 мл 0,9% раствора натрия хлорида и подогревают до температуры °С и перемешивают пипеткой 8-10 раз;

- таблетки: 6 таблеток растирают в стерильной фарфоровой ступке фарфоровым пестиком, дробно (из расчета 1 мл на 1 таблетку) добавляют 6 мл 0,9% раствора натрия хлорида, подогретого до 37°С, и перемешивают до гомогенной суспензии, затем суспензию пипеткой переносят в стерильный флакон;

- капсулы: содержимое 6 капсул помещают во флакон с 6 мл 0,9% раствора натрия хлорида (из расчета 1 мл на 1 капсулу), флаконы помещают на водяную баню при температуре °С, через 20-30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния;

- суппозитории: 6 суппозиториев заливают (из расчета 0,5 мл на 1 суппозиторий 3 мл) 0,9% раствором натрия хлорида, предварительно нагретым до °С, выдерживают на водяной бане при температуре °С в течение 20-30 мин и перемешивают пипеткой до гомогенного состояния.

Методика

Испытания проводят на 5 здоровых белых беспородных мышах одного пола массой 14-16 г, прошедших карантин и ранее не использованных в экспериментах. Условия содержания и кормления должны обеспечивать нормальную жизнедеятельность животных. Животных не кормят за 3-5 ч до испытания.

Перед испытанием определяют групповую массу тела мышей. Взвешивание проводят непосредственно перед опытом.

Тест-доза испытуемого препарата должна содержаться в объеме 0,5 мл или не более 1,0 мл на животное. Перед каждым введением суспензию приготовленного испытуемого препарата, перемешивают 6-8 раз. Суспензию вводят каждой мыши перорально в желудок при помощи специальной насадки на шприц*(4), со скоростью 0,1 мл/с.

Наблюдение за мышами осуществляют в течение 5 сут. По истечении срока наблюдения определяют групповую массу тела мышей.

Учет результатов

Испытуемый препарат выдерживает испытание, если в течение всего срока наблюдения:

- отсутствует гибель подопытных животных;

- отсутствует снижение групповой массы тела животных по сравнению с исходной.

В случае гибели в течение срока наблюдения хотя бы одного животного или снижении групповой массы тела, испытание повторяют на удвоенном количестве животных. Если при повторном контроле ни одно из животных не погибает и групповая масса не снижается по сравнению с исходной массой, испытуемый препарат считают выдержавшем испытание.

Раздел 2. Изучение вирулентности

Вирулентность - биологическое свойство микроорганизмов, характеризующее степень их патогенности. Вирулентность является штаммовым признаком, который может усиливаться или ослабляться вплоть до полного исчезновения под влиянием различных факторов внешней среды. Для характеристики вирулентности пользуются количественными показателями, определяющими способность исследуемой микробной культуры вызывать гибель "искусственно" зараженных ею подопытных животных.

Пробоподготовка

Приготовление испытуемого производственного штамма:

Восстановление производственного штамма (из лиофилизированного состояния или со среды хранения) проводят с использованием адекватных питательных сред и в адекватных условиях, принятых для определенной таксономической группы микроорганизмов в соответствии с ОФС "Производственные штаммы и штаммы для контроля". Для испытания используют культуру второго или третьего пассажа, выращенную на адекватной плотной питательной среде. Выросшую культуру, с поверхности плотной питательной среды, смывают 0,9% раствором натрия хлорида. Смыв собирают в стерильную посуду (флакон, пробирку и т.д.).

В полученной суспензии определяют концентрацию микробных клеток, используя стандартный образец мутности 10 ЕД ОСО 42-28-85 или международный стандарт мутности (The International Reference Preparation of Opacity of 10 International Units). Из полученной суспензии делают ряд десятикратных разведений в 0,9% растворе натрия хлорида, получая тест-дозы - ОЕ в объеме 0,5 мл (если в частной фармакопейной статье даны иные указания количеству микробных клеток в тест-дозе, то следуют им).

Методика

Испытание вирулентности испытуемого препарата осуществляют при однократном внутрибрюшинном введении беспородным белым мышам тест-доз.

Испытания проводят на здоровых белых беспородных мышах одного пола массой 12-14 г, прошедших карантин и ранее не использованных в экспериментах. Условия содержания и кормления должны обеспечивать нормальную жизнедеятельность животных.

В опыте на одну тест-дозу используют по 10 мышей. Перед испытанием определяют групповую массу тела мышей. Взвешивание проводят непосредственно перед опытом.

Тест-доза испытуемого препарата должна содержаться в объеме 0,5 мл растворе натрия хлорида 0,9%. Тест-дозу вводят каждой мыши внутрибрюшино со скоростью 0,1 мл/с.

Наблюдение за мышами осуществляют в течение 5 - 7 сут (если в частной фармакопейной статье даны иные указания по определению сроков наблюдения, то следуют им).

За животными наблюдают ежедневно, отмечая в протоколе опыта количество живых и павших животных. По истечении срока наблюдения определяют групповую массу тела мышей.

Учет результатов

Испытуемый штамм выдерживает испытание, если в течение всего срока наблюдения ни в одной из групп:

- не погибает ни одно из подопытных животных;

- ни у одного из животных не проявятся признаки интоксикации;

- групповая масса тела мышей не снижается по сравнению с исходной массой.

При отсутствии гибели животных, признаков нарушения здоровья и потери массы тела к концу срока наблюдения следует сделать заключение, что при введении максимально переносимой дозы штамм не обладает вирулентностью.

В случае гибели в течение срока наблюдения хотя бы одной мыши или снижении групповой массы тела, испытание повторяют на удвоенном количестве животных. Если при повторном контроле ни одна из мышей не погибает и групповая масса не снижается по сравнению с исходной массой, испытуемый штамм бактерий считают не вирулентным.

Раздел 3. Изучение токсичности

Токсичность является важной характеристикой микроорганизмов, определяющей их способность вызывать патологические изменения в организме человека. Токсичность бактерий обусловлена наличием эндотоксинов, которые термостабильны и высвобождаются из бактериальных клеток грамотрицательных бактерий после их разрушения

Пробоподготовка

Приготовление испытуемого производственного штамма бактерий:

Восстановление производственного штамма бактерий (из лиофилизированного состояния или со среды хранения) проводят с использованием адекватных питательных сред и в адекватных условиях, принятых для определенной таксономической группы бактерий в соответствии с ОФС "Производственные штаммы и штаммы для контроля". Для испытания используют культуру второго или третьего пассажа, выращенную на адекватной плотной питательной среде. Выросшую культуру бактерий, с поверхности плотной питательной среды, смывают 0,9% раствором натрия хлорида. Смыв бактерий со среды собирают в стерильную посуду (флакон, пробирку и т.д.), затем инактивируют на водяной бане при температуре 100°С в течение 1 ч.

После остывания в полученной суспензии определяют концентрацию микробных клеток, используя стандартный образец мутности 10 ЕД ОСО 42-28-85 или международный стандарт мутности (The International Reference Preparation of Opacity of 10 International Units). Из полученной суспензии делают ряд десятикратных разведений в 0,9% растворе натрия хлорида, получая тест-дозы - микробных клеток в объеме 0,5 мл (если в частной фармакопейной статье даны иные указания количеству микробных клеток в тест-дозе, то следуют им).

Методика

Испытание токсичности испытуемого штамма бактерий осуществляют при однократном внутрибрюшинном введении беспородным белым мышам тест-доз.

Испытания проводят на здоровых белых беспородных мышах одного пола массой 12-14 г, прошедших карантин и ранее не использованных в экспериментах. Условия содержания и кормления должны обеспечивать нормальную жизнедеятельность животных.

В опыте на одну тест-дозу используют по 10 мышей. Перед испытанием определяют групповую массу тела мышей. Взвешивание проводят непосредственно перед опытом.

Тест-доза испытуемого препарата должна содержаться в объеме 0,5 мл растворе натрия хлорида 0,9%. Тест-дозу вводят каждой мыши внутрибрюшино со скоростью 0,1 мл/с.

Наблюдение за мышами осуществляют в течение 5 сут (если в частной фармакопейной статье даны иные указания по определению сроков наблюдения, то следуют им). За животными наблюдают ежедневно, отмечая в протоколе опыта количество живых и павших животных. По истечении срока наблюдения определяют групповую массу тела мышей.

Учет результатов

Испытуемый штамм бактерий выдерживает испытание, если в течение всего срока наблюдения ни в одной из групп:

- не погибает ни одно из подопытных животных;

- ни у одного из животных не проявятся признаки интоксикации;

- групповая масса тела мышей не снижается по сравнению с исходной массой.

При отсутствии гибели животных, признаков нарушения здоровья и потери массы тела к концу срока наблюдения следует сделать заключение, что при введении максимально переносимой дозы штамм не обладает токсичностью.

В случае гибели в течение срока наблюдения хотя бы одной мыши или снижении групповой массы тела, испытание повторяют на удвоенном количестве животных. Если при повторном контроле ни одна из мышей не погибает и групповая масса не снижается по сравнению с исходной массой, испытуемый штамм бактерий считают не токсичным.

Раздел 4. Изучение токсигенности

Токсигенность бактерий фенотипически проявляется в образовании белковых токсинов (экзотоксинов), полностью или частично секретируемых в окружающую среду.

Пробоподготовка

Приготовление испытуемого производственного штамма бактерий:

Восстановление производственного штамма бактерий (из лиофилизированного состояния или со среды хранения) проводят с использованием адекватных питательных сред и в адекватных условиях, принятых для определенной таксономической группы бактерий в соответствии с ОФС "Производственные штаммы и штаммы для контроля". Для испытания используют культуру второго или третьего пассажа, выращенную на адекватной жидкой питательной среде при температуре °С в течение 10 сут, для накопления в среде токсина (в случае токсигенности штамма бактерий). По истечению срока культивирования пробирку с выросшей культурой центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 мин либо фильтруют через бактериальный фильтр. Полученную надосадочную жидкость или фильтрат (неразведенный токсин) используют в тест-дозах: 0,1; 0,5; 1,0 мл.

Методика

Испытание токсигенности испытуемого штамма бактерий осуществляют при однократном внутрибрюшинном введении беспородным белым мышам тест-доз надосадочной жидкости или фильтрата.

Испытания проводят на здоровых белых беспородных мышах одного пола массой 12-14 г, прошедших карантин и ранее не использованных в экспериментах. В опыте на одну тест-дозу используют по 10 мышей. Условия содержания и кормления должны обеспечивать нормальную жизнедеятельность животных. Перед испытанием определяют групповую массу тела мышей. Взвешивание проводят непосредственно перед опытом.

Полученную надосадочную жидкость или фильтрат вводят мышам внутрибрюшинно в тест-дозах: 0,1; 0,5; 1,0 мл. Контролем служит группа мышей, получавших стерильную жидкую среду в том же объеме.

Наблюдение за мышами осуществляют в течение 5 сут (если в частной фармакопейной статье даны иные указания по определению сроков наблюдения, то следуют им). За животными наблюдают ежедневно, отмечая в протоколе опыта количество живых и павших животных. По истечении срока наблюдения определяют групповую массу тела мышей.

Учет результатов

Испытуемый штамм бактерий выдерживает испытание, если в течение всего срока наблюдения:

- не погибает ни одно из подопытных животных,

- ни у одного из животных не проявятся признаки интоксикации

- групповая масса тела мышей не снижается по сравнению с исходной массой.

В случае гибели в течение срока наблюдения хотя бы одной мыши или снижении групповой массы тела, испытание повторяют на удвоенном количестве животных. Если при повторном контроле ни одна из мышей не погибает и групповая масса не снижается по сравнению с исходной массой, испытуемый штамм бактерий считают не токсигенным.

______________________________

*(1) Далее по тексту пробиотические производственные штаммы и пробиотики для медицинского применения будут называться "испытуемый препарат"

*(2) Человеческая доза - это доза испытуемого препарата, указанная на этикетке или в инструкции по медицинскому применению (листке-вкладыше).

*(3) Далее по тексту "стандартный образец мутности 10 ЕД"

*(4) Игла с незначительным изгибом и наплавленной оливой или резиновый зонд. Наличие изгиба допускает введение иглы в пищевод животного.