Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42 "Определение подлинности и чистоты генно-инженерных препаратов методом изоэлектрического фокусирования"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42
"Определение подлинности и чистоты генно-инженерных препаратов методом изоэлектрического фокусирования"

Вводится впервые

Метод изоэлектрического фокусирования используется для оценки генно-инженерных продуктов, а также некоторых высокоочищенных биотехнологических препаратов, предназначенных для использования людьми.

Электрофоретическое разделение белков методом изоэлектрического фокусирования происходит под действием электрического поля в градиенте рН в соответствии с их изоэлектрической точкой (рI). Местоположение каждого белка определяется значением его изоэлектрической точки. При достижении белком изоэлектрической точки в градиенте рН, его суммарный заряд становится равным нулю и он перестает перемещаться в электрическом поле. В результате электрофоретического разделение исследуемого вещества может происходить диффузия белковых молекул из зоны фокусирования, но, попадая в более кислую или щелочную среду, молекулы белка будут терять нейтральность и под действием электрического поля снова возвращаться в зону изоэлектрической точки. Для создания градиента рН применяют смеси синтетических полиаминополикарбоновых кислот (амфолины) в диапазоне изоэлектрических точек (рI) от 3,0 до 10,0 единиц рН. Смесь амфолитов помещают в стабилизационную среду (полиакриламидный или агарозный гель) и подают напряжение, в результате создается градиент, в котором рН увеличивается в направлении от анода (+) к катоду (-).

Для ускорения процесса фракционирования белков используют максимально допустимую напряженность электрического поля. Ограничением служит невозможность эффективного отвода выделяемого тепла. Использование тонких гелей и эффективного охлаждения пластинки с помощью водяного термостата предотвращает перегревание геля и способствует хорошему разделению белков.

Максимальное различие между значениями рI компонентов, определяют по формуле:

D - коэффициент диффузии белка;

dpH/dx - градиент рН;

Е - напряженность электрического поля, в вольтах на сантиметр;

(-du/dpH) - изменение подвижности вещества при изменении рН в области близкой к pI.

Формула показывает, что хорошее разрешение может быть получено для веществ с низким коэффициентом диффузии и достаточно большим значением изменения подвижности в точке близкой к изоэлектрической. Хорошему разрешению способствует высокая напряженность поля и плавный градиент рН. Разрешающая способность ИЭФ при использовании геля, приготовленного с применением амфолитов, составляет 0,02 единицы рН, а при использовании иммобилизованных гелей (химически фиксированным градиентом рН) - около 0,001 единицы рН.

Испытанию подлежат субстанция и очищенный продукт до добавления стабилизаторов, наполнителей, консервантов и других компонентов, входящих в состав лекарственной формы. Методика также может использоваться для анализа готовой продукции в сравнении со стандартным образцом (стандартные образцы указываются в частных фармакопейных статьях).

Практические аспекты

Присутствие в генно-инженерных продуктах, а также некоторых высокоочищенных биотехнологических препаратов солей в высоких концентрациях (более 0,1 М) может искажать градиент рН и форму сфокусированных белков. Для нейтрализации этого эффекта образцы лучше готовить в деионизованной воде или 1-2% растворе глицина или амфолитов (амфолины, фармалиты, сервалиты, биолиты). При необходимости для пробоподготовки возможно использование специальных центрифужных концентраторов (фильтров), диализа или гель-фильтрации.

Время завершения процесса изофокусирования в полиакриламидных гелях, как правило, определяет по предварительно окрашенным стандартным белкам (маркерам) (например, гемоглобину), нанесенным на гель в различные точки одновременно с исследуемыми образцами. Процесс считается завершенным в том случае, когда все стандарные образцы образуют полосы в установленном месте. Если завершение процесса изофокусирования определяют по времени, прошедшем с момента нанесения образцов, установленное время должно быть обосновано.

Метод ИЭФ может быть применен:

- для подтверждения подлинности, когда подвижность испытуемого образца сравнима с подвижностью стандартного образца или маркера pI;

- для оценки примесей по интенсивности окрашивания полос относительно основных компонентов по сравнению со стандартным образцом (требует валидации);

- для количественного определения по интенсивности окраски полос с помощью денситометра или аналогичного оборудования (требует валидации).

Оборудование

Прибор для проведения изоэлектрофокусирования состоит из:

- высоковольтного источника питания с программой, специально разработанной для IEF, с максимальным напряжением не менее 3000 В, током 300 мA и мощностью 300 Вт;

- электрофорезной камеры из жесткой пластмассы с камерой, содержащей охлаждающую пластину из соответствующего материала для поддержания геля;

- платиновых электродов, которые соединяются с гелем посредством электродных (бумажных или гелевых) полосок необходимой ширины, длины и толщины, пропитанных анодным и катодным буфером.

Изоэлектрфокусирование в полиакриламидных гелях

Форма для приготовления полиакриламидного геля состоит из двух стеклянных пластин, пластикового листа, прокладок (спейсеров) и зажимов, скрепляющих всю конструкцию.

Для метода ИЭФ используют гели с максимальной пористостью и достаточной механической прочностью. Эти свойства зависят от относительного содержания акриламида и бисакриламида (используемые для сшивки гелей).

Поскольку молекулярная масса большинства известных белков не превышает 200000 Да возможно использование 7,5% гелей.

Примечания.

Приготовление основного 30% раствора акриламида

29,1 г акриламида и 0,9 г метиленбисакриламида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 70 мл деионизованной воды, перемешивают до полного растворения, доводят объем раствора деионизованной водой до метки и вновь перемешивают. Далее раствор фильтруют (условия фильтрования указывают в частной фармакопейной статье). Раствор хранят при температуре от 2 до 8°С в емкости из темного стекла в течение 1 мес.

Приготовление полиакриламидного геля.

Смешивают 30% раствор акриламида со смесью амфолитов в соотношении, указанном в частной фармакопейной статье и осторожно перемешивают.

Подготовленный раствор акриламида с амфолитами (соотношение объемов указывают в частной фармакопейной статье) помещают на магнитную мешалку, прибавляют 0,25 объема 10% раствора аммония персульфата, 0,25 объема раствора ТЕМЕD (тетраметилендиамина) и перемешивают. Заливают полученный раствор в подготовленную форму. Полимеризация геля происходит в течение 30-40 мин.

Сборка формы для полиакриламидного геля.

На нижнюю стеклянную пластину помещают пластиковый лист, на него помещают прокладки (спейсеры) и сверху помещают вторую стеклянную пластину и скрепляют конструкцию зажимами.

Методика проведения ИЭФ.

Охлаждающую пластину помещают в камеру для электрофореза, соединяют с термостатом, установленным на температуру от 8 до 10°С.

На охлаждающую пластину наносят 1,0 мл деионизованной воды или керосина.

Форму разбирают, гель на полиэфирной пленке (пластиковом листе) переносят на охлаждающую пластину, таким образом, чтобы вода касалась всего края геля. Медленно, избегая появления пузырьков воздуха, гель осторожно помещают на охлаждающую пластину. Одну электродную полоску смачивают анодным буферным раствором и помещают анодный конец геля (маркировка (+) на охлаждающей пластине). Вторую электродную полоску смачивают катодным буферным раствором и помещают на катодный конец геля (маркировка (-) на охлаждающей пластине). Составы катодного и анодного буферных растворов приводят в частной фармакопейной статье. Аппликаторы для нанесения испытуемых и стандартных образцов помещают на поверхность геля, наносят необходимое количество испытуемых и стандартных образцов, указанное в частных фармакопейных статьях. Для калибровки геля наносят растворы белков (маркеры) с известными величинами изоэлектрических точек (коммерческие наборы маркеров с диапазоном изоэлектрических точек 3-10; 2,5-6,5; 5-10,5 или с маркерами, указанными в частных фармакопейных статьях). Количество наносимых испытуемых и стандартных образцов, а также маркеров приводят в частной фармакопейной статье. Вместо бумажных аппликаторных полосок, возможно использование геля с лунками для проб. Держатель электродов помещают в электрофоретическую камеру и устанавливают электроды вдоль центров электродных полосок на поверхности геля. Соединяют электроды с основной частью камеры и закрывают камеру крышкой. Подключают камеру к источнику питания (тока). Проводят изоэлектрическое фокусирование в условиях, указанных в частной фармакопейной статье. После окончания электрофореза отключают источник питания, снимают крышку, убирают электроды. Аккуратно, пинцетом удаляют электродные полоски и аппликаторы с геля. Гель немедленно переносят в емкость с фиксирующим раствором и выдерживают при покачивании, затем фиксирующий раствор удаляют. Гель промывают трижды деионизованной водой, прибавляют окрашивающий раствор Кумасси R-250 или G-250, состав и приготовление которых указывают в частных фармакопейных статьях. При окраске Кумасси R-250 гель отмывают в 25% растворе этанола и 8% растворе уксусной кислоты или при окраске Кумасси G-250 в деионизованной воде до тех пор, пока на прозрачном фоне не станут четко видны полосы.

Для окраски геля возможно применение раствора серебра нитрата, приготовление которого, а также условия отмывания описывают в частной фармакопейной статье.

Время выдерживания геля в фиксирующем, окрашивающем растворах и время отмывания геля должны быть указаны в частной фармакопейной статье. Регистрируют положение и интенсивность полос как указано в частной фармакопейной статье.

Примечания.

Приготовление растворов.

Описание приготовления растворов: 10% раствора аммония персульфата; раствора ТЕМЕД (тетраметилэтилендиамин); фиксирующего раствора; 25% раствора спирта этилового и 8% раствора кислоты уксусной, указывается в частных фармакопейных статьях.

Особенности методики, требующие внимания

Исследуемые образцы могут наноситься на любой участок поверхности геля, но для защиты белков от экстремальных (значений) величин рН, пробы не должны наноситься в непосредственной близи от электродов. При валидации метода пробы могут быть нанесены на гель в трех позициях: посередине геля и на его концах. Полосы проб белка, нанесенные на противоположные концы геля, могут быть различными (не одинаковыми).

1. Следует не допускать слишком длительное фокусирование, т.к. в геле может возникнуть процесс, называемый катодным дрейфом, при котором с течением времени градиент рН разрушается. Причины данного явления не до конца изучены. Одними из факторов могут быть электроэндоосмос и абсорбция диоксида углерода. Катодный дрейф наблюдается в виде миграции сфокусированный белковой полосы от катодного конца геля. Для решения этой проблемы могут быть использованы иммобилизованные гели.

2. Во время фокусирования необходимо обеспечить эффективное охлаждение пластины, на которую помещен гель (от 8 до 10°С). Высокое напряжение электрического поля, используемого при изоэлектрическом фокусировании, может привести к перегреванию и влиять на качество разделения.

Особенности методики, требующие внимания, а также особенности методики должны быть указаны в частной фармакопейной статье.

Возможные модификации методики

Особенности некоторых исследуемых веществ могут потребовать внесения следующих изменений в методику:

- из-за снижения растворимости белков вблизи изоэлектрической точки и опасности их осаждения в состав геля вводят мочевину. Допускается добавление в гель от 3 М до 9 М растворов мочевины. Для предотвращения карбомоилирования белка следует использовать добавление только свежеприготовленных растворов мочевины;

- добавление в гель детергентов: неионных (например, октилглюкозид, Тритон Х-100 или Nonidet P-40 (NP-40)) или цвиттерионных (например, 3-3((3-холамидопропил)диметиламмоний-1-пропансульфонат - СHAPS или 3-3((3-холамидопропил)диметиламмоний-2-гидрокси-1-пропансульфонат - CHAPSO);

- добавление амфолита к исследуемому образцу для предотвращения агрегации и преципитации белков.

- использование альтернативных методов детекции.

Модификации методики должны быть отражены в частной фармакопейной статье.

Критерии пригодности системы

Результаты изоэлектрического разделения могут учитываться, если электрофореграммы удовлетворяют следующим критериям:

- формирование стабильного градиента рН с необходимыми (требуемыми, заданными) характеристиками, оцениваемого, например, с использованием маркеров pI (стандартных образцов) с известными величинами изоэлектрических точек, в том числе предварительно окрашенных;

- другие обоснованные критерии приемлемости результатов (например, разделение двух выбранных белков или компонентов одного белка).

Критерии приемлемости результатов

- совпадение электрофореграммы исследуемого образца с электрофореграммой образца сравнения, например, соответствующего стандартного образца на основе очищенного белка (субстанции);

- выявление образца в минимально установленной концентрации.

Для оценки генно-инженерных продуктов, а также некоторых высокоочищенных биотехнологических препаратов можно использовать методику изоэлектрического фокусирования с подтвержденными валидационными характеристиками.

Особенности валидации методики

При использовании методики для оценки подлинности необходимо обосновать критерии приемлемости результатов. При использовании стандартного образца на основе очищенного белка аттестуемая характеристика должна быть научно обоснована, стандартный образец должен быть аттестован в установленном порядке.

При использовании методики для оценки чистоты необходимо представить данные, обосновывающие предел обнаружения примеси, а также минимальную разницу в pI компонентов, которую выявляет методика (разрешающая способность). При количественном определении - представить данные, обосновывающие предел количественного определения примеси, минимальную разницу в pI компонентов, которую выявляет методика, линейный диапазон при определении основного компонента, воспроизводимость методики. Целесообразно использование стандартного образца на основе очищенного белка с научно обоснованной аттестуемой характеристикой.

При внесении изменений в методику изоэлектрического фокусирования, описанную в частной фармакопейной статье, должны быть подтверждены валидационные характеристики ранее утвержденной методики. Валидации подлежат следующие изменения:

- использование коммерческих готовых гелей (precast gels), наборов для окрашивания и обесцвечивающих растворов;

- использование гелей с иммобилизованным градиентом рН;

- использование гелей с пластиковыми аппликаторами для нанесения образцов;

- использование кассет с гелем различных размеров, включая ультратонкие (0,2 мм) гели;

- использование различных объемов проб, электродных полосок и аппликаторов, изготовленных не из бумаги;

- изменение условий проведения ИЭФ, включая изменения напряжения, размера геля и используемого оборудования, использование фиксированного времени разделения, вместо слежения за достижением определенной точки выбранного маркера рI;

- использование автоматизированного оборудования;

- замена полиакриламидных гелей на агарозные.