Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина гепатита В рекомбинантная"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина гепатита В рекомбинантная"

Вводится впервые

Вакцина гепатита В рекомбинантная представляет собой поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), серотипа ad или ay, полученный методом рекомбинантной ДНК, очищенный с помощью последовательно применяемых физико-химических методов и адсорбированный на алюминия гидроксиде или другом сорбенте, разрешенном для парентерального введения. Антиген продуцируется культурой трансформированных дрожжевых клеток (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris или Hansenula polymorpha).

Вакцина предназначена для профилактики вирусного гепатита В.

Особенности производства. Препарат содержит в 1 мл: 20 мкг поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), вспомогательные вещества: адьювант - алюминия гидроксид 0,5 мг; консервант - тиомерсал 50 мкг (возможен выпуск препарата без консерванта); фосфатно - солевые буферные растворы.

Характеристика субстанции.

Степень чистоты субстанции должна быть охарактеризована с помощью методов определения доли потенциальных загрязняющих белков в общем белке препарата - методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ//PAGE) или с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Степень очистки HBsAg должна быть не менее 95%. Количество остаточной ДНК должно составлять не более 10 нг/мл.

Содержание HBsAg в субстанции определяют методом ИФА. В качестве образца сравнения может использоваться высокоочищенный референс-препарат предприятия с известным содержанием HBsAg и белка. Образцы сравнения на основе продукта, содержащего консервант, не пригодны в случае испытания препаратов, не содержащих консервант.

Содержание липидов и углеводов должно определяться в субстанции (in balk) до осаждения препарата на алюминия гидроксиде.

Пенициллин и другие бета-лактамы не должны использоваться ни на одном из этапов производства ввиду высокой сенсибилизирующей активности.

Если при очистке вакцины используются моноклональные антитела (иммунологическая аффинная хроматография для очистки HBsAg), используемые антитела должны быть охарактеризованы и определена степень их очистки.

Референс-препараты. В настоящее время международные стандарты и препараты сравнения для определения иммуногенности рекомбинантных вакцин против гепатита В отсутствуют. Поэтому для этой цели могут быть использованы препараты сравнения к конкретному продукту того же производства, представляющие собой часть репрезентативной серии, иммуногенная активность которой была подтверждена в тестах in vivo, и соответствовала иммуногенности серии вакцины, использованной в клинических исследованиях на молодых здоровых добровольцах, и вызывала образование антител не менее 10 мМЕ/мл после полного курса вакцинации.

Испытания готового продукта.

Описание. Гомогенная суспензия белого с серым оттенком цвета без видимых посторонних включений, при отстаивании разделяющаяся на 2 слоя: верхний - бесцветная прозрачная жидкость, нижний - белый осадок, легко разбивающийся при встряхивании.

Подлинность. Препарат должен быть идентичен поверхностному антигену вируса гепатита В (HBsAg). Определение проводят методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем для выявления HBsAg с чувствительностью не более 0,1 МЕ/мл в соответствии с инструкцией по применению (см. раздел "Специфическая активность"). Возможно определение подлинности методом электрофореза в полиакриламидном геле в редуцирующих условиях при окрашивании раствором нитрата серебра после десорбции белка согласно ОФС "Электрофорез". При окрашивании геля раствором нитрата серебра должна выявляться основная полоса мономера с молекулярной массой  кДа, также может присутствовать дополнительная менее интенсивная полоса димера с молекулярной массой  кДа.

Размер частиц. Суспензия вакцины должна свободно проходить в шприц через иглу N 0840.

Время седиментационной устойчивости. Суспензия вакцины не должна расслаиваться в течение 5 мин после встряхивания.

Видимые механические включения. Видимые механические включения должны отсутствовать. Определение проводят визуально в соответствии с ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

рН. Значения рН должны быть от 6,8 до 7,6. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Извлекаемый объём. Извлекаемый объём должен быть не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения"

Стерильность. Препарат должен быть стерильным. Испытания проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации в соответствии с ОФС "Стерильность".

Бактериальные эндотоксины. Количественное содержание бактериальных эндотоксинов должно быть указано в частной фармакопейной статье. Определение проводят в соответствии с ОФС "Бактериальные эндотоксины (Гель-тромб тест. Качественный анализ)".

Пирогенность. Препарат должен быть апирогенным. Определяют в соответствии с требованиями ОФС "Пирогенность". Тест-доза - 0,5 мл на 1 кг массы кролика. Вводится внутривенно. Определение пирогенности является альтернативным определению бактериальных эндотоксинов.

Общий белок. Содержание белка в препарате должно быть не более 25 мкг/мл. Определение проводят по методу Лоури с предварительной десорбцией белка в соответствии с ОФС "Определение белка". Условия десорбции должны быть указаны частной фармакопейной статьей.

Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность" (Тест для вакцин и сывороток). Тест-доза для морских свинок - 1 мл (20 мкг) подкожно, для мышей - 1 мл (20 мкг) внутрибрюшинно. Наблюдение проводят в течение 7 суток.

Специфическая активность. Определяют иммуноферментным методом "Определение содержания HBsAg методом ИФА", который является альтернативным методу "Иммуногенная активность на мышах in vivo".

Определение содержания HBsAg методом ИФА. Содержание HBsAg должно быть не менее 80% по отношению к препарату сравнения. В качестве препарата сравнения используют референс-вакцину фирмы-производителя. Определение проводят методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем для выявления HBsAg с чувствительностью не более 0,1 МЕ/мл в соответствии с инструкцией по применению.

Процедура приготовления растворов для разведений и рабочие разведения должны быть описаны в частной фармакопейной статьей.

Определение содержания HBsAg в испытуемом образце вакцины проводят параллельно с определением содержания антигена в референс - вакцине фирмы-производителя. Процент содержания антигена в испытуемом препарате должен быть определен частной фармакопейной статьей. Постановку контроля осуществляют в соответствии с инструкцией по применению используемой тест-системы.

Учет результатов. Содержание HBsAg в испытуемой вакцине и в образце сравнения рассчитывают методом параллельных линий (Программа "PARALINE" или аналогичная). В результате автоматического дисперсионного анализа получают значения относительной активности поверхностного антигена по отношению к референс - препарату в процентах.

Иммуногенная активностьна мышах in vivo. Вакцина должна стимулировать выработку антител к HBsAg у однократно иммунизированных мышей линии BALB/c. Отношение дозы иммуногенной активности референс-препарата вакцины гепатита В, вызывающей выработку антител у 50% мышей , к испытуемой вакцины должно быть не менее 0,5.

В качестве препарата сравнения используют референс - вакцину производителя.

Раствор для разведения образцов вакцины: 0,9% раствор натрия хлорида, содержащий 0,35 - 0,65 мг/мл алюминия гидроксида.

Процедура приготовления образцов отрицательного контроля, испытуемой вакцины и референс - препарата для иммунизации мышей, а также количество животных, объем и способ введения, сроки испытания должны быть описаны в частной фармакопейной статьей.

По окончанию испытания животных обескровливают. Полученные индивидуально от каждого животного сыворотки анализируют на наличие антител методом ИФА с использованием тест-систем для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В с чувствительностью 5,0 - 10 мМЕ/мл в соответствии с инструкцией по применению.

Учет результатов. Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности сывороток группы Е (отрицательный контроль). Положительными считают сыворотки, показания оптической плотности которых равны или выше среднего арифметического отрицательного контроля плюс коэффициент тест-системы. Для каждой группы мышей вычисляют процент эффективности (показатель сероконверсии) по формуле:

Методом пробит-анализа или методом скользящих средних рассчитывают испытуемой серии вакцины и референс - образца.

Полнота сорбции антигена. Количество несвязанного поверхностного антигена вируса гепатита В должно быть не более 1% от номинального количества. 1000 мкл испытуемого образца вакцины центрифугируют при 6000 об/мин в течение 5 мин при температуре от 15°С до 25°С . Процедура разведения надосадочной жидкости, референс - препарата и буфер для разведений должны быть указаны в частной фармакопейной статьей. Определение несвязанного поверхностного антигена в надосадочной жидкости проводят методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем для выявления HBsAg с чувствительностью не более 0,1 МЕ/мл по отношению к референс - препарату. Количество несвязанного поверхностного антигена вируса гепатита В определяют по калибровочному графику референс - образца, используя программу "PARALINE" или аналогичную, либо по формуле:

Полнота сорбции = (А x фактор разведения/В x фактор разведения) x 100%, где А - среднее значение оптической плотности надосадочной жидкости; В - среднее значение оптической плотности референс препарата.

Тиомерсал. В препаратах содержащих тиомерсал от 0,03 мг до 0,07 мг в 1 мл вакцины; от 0,018 до 0,035 мг в 0,5 мл вакцины. Определение проводят колориметрическим или атомно-абсорбционным методом в соответствии с ОФС "Определение тиомерсала (мертиолята)".

Алюминия гидроксид. От 0,35 мг до 0,65 мг в 1 мл и от 0,18 мг до 0,32 мг в 0,5 мл. Определение проводят в соответствии с ОФС "Комплексонометрическое титрование. Определение ионов алюминия в сорбированных иммунобиологических препаратах".

Производственный штамм. Производственный штамм - рекомбинантный штамм дрожжей, содержащий HBsAg (определяется штамм-продуцент дрожжей и субтип вируса гепатита В) должен быть указан в частной фармакопейной статье. В частной фармакопейной статьей должны быть указаны полные характеристики рекомбинантного производственного штамма: клетки хозяина в сочетании с системой вектора экспрессии, отсутствие посторонних примесей в препарате, в том числе клеточной ДНК; должны быть приведены данные о стабильности плазмиды в процессе хранения.

Морфологические, культуральные и физико-биохимические свойства штамма-продуцента должны сохраняться при температуре минус °С в течение 1 года.

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства". Маркировка вторичной упаковки должна обязательно содержать предупредительные надписи:

"Перед употреблением встряхивать",

"Хранить в недоступном для детей месте",

"Для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических учреждений",

"Не замораживать"

Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8°С.