Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42- "Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42-
"Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК"

Вводится впервые

Настоящая фармакопейная статья определяет основные требования к производству лекарственных средств, получаемых с использованием методов рекомбинантной ДНК и контролю качества конечного продукта.

Активные субстанции указанных препаратов получают с помощью культур охарактеризованных клеток, используемых в качестве систем экспрессии, которыми могут быть бактерии, дрожжи, клетки млекопитающих и др. Полученные таким образом активные субстанции, являясь действующим веществом лекарственных препаратов, представляют собой белки и пептиды, их производные и вещества, компонентами которых они являются. К таким препаратам относятся цитокины, моноклональные антитела, вакцины с использованием рекомбинантных белков (HBsAg, белки вируса папилломы и др.), рекомбинантные факторы плазмы, рецепторы клеток и др.

Статья не распространяется на модифицированные клетки и микроорганизмы, например живые вакцины, применяемые в качестве лекарственных препаратов.

Требования, приведенные в настоящей фармакопейной статье, могут быть дополнены в частной фармакопейной статье с учетом специфических свойств лекарственного средства.

Клетки хозяина - клетки микроорганизмов или эукариотических клеточных линий, используемые для получения продукта, до внесения в них вектора.

Штамм-продуцент - комплекс клетки хозяина и вектора.

Значимые генотипические и фенотипические маркеры - маркеры, позволяющие осуществлять идентификацию штамма клеточной линии и наличие экспрессирующей конструкции.

Конечный балк (полуфабрикат) активной субстанции - конечный продукт после завершения производственного процесса, полученный из объединенного сбора продукта. Он содержится в одной или более емкостях и используется для приготовления готовой лекарственной формы. Формирование конечной серии этого продукта должно быть четко установлено и документировано производителем.

Пилотное производство - ограниченное по объему продукции производство с помощью процедуры, полностью соответствующей той, которая будет применена при полномасштабном коммерческом производстве (условия размножения клеток, их сбор, этапы очистки продукта и др.)

Сайт интеграции - участок генома клетки-хозяина, в который включаются одна или более копий экспрессирующей конструкции.

Экспрессирующая конструкция - экспрессирующий вектор, который содержит кодирующую последовательность рекомбинантного белка и элементы, необходимые для его экспрессии.

Фланкирующие регуляторные участки - некодирующие нуклеотидные последовательности, примыкающие к 5' и 3' концам кодирующей последовательности продукта, которые содержат важные элементы, влияющие на транскрипцию, трансляцию или стабильность кодирующей последовательности. Эти участки включают, например, промотор, энхансер и последовательности для сплайсинга и не включают точки начала репликации и гены устойчивости к антибиотикам.

Общие положения

Производство лекарственных средств, получаемых с использованием методов рекомбинантной ДНК, должно быть основано на системе банков клеток, которая включает Основной банк клеток (ОБК) и Рабочий банк клеток (РБК).

Используемые в процессе производства клетки и материалы биологического происхождения должны быть охарактеризованы и соответствовать требованиям микробиологической и вирусной безопасности.

В частности, сыворотка крупного рогатого скота должна контролироваться и не должна содержать потенциально опасные вирусы (вирус бычьей диареи, инфекционного бычьего ринотрахеита и парагриппа 3). Кроме того, бычья сыворотка и другие биологические продукты, полученные от крупного рогатого скота, должны соответствовать требованиям, изложенным в руководстве "Минимизация риска передачи агентов, вызывающих губчатую энцефалопатию, через лекарственные продукты".

Все этапы процесса производства с целью предотвращения возможной контаминации инфекционными агентами готового продукта должны быть валидированы.

Для подтверждения соответствия при получении продукта с помощью технологии рекомбинантной ДНК важна оценка как конечного очищенного белка, так и экспрессирующей конструкции.

Оценка экспрессирующей конструкции является частью оценки качества, показывающая, что в клетку-хозяина введена последовательность, соответствующая требуемому белку, и что она сохраняется в клеточной культуре без изменений до конца продуктивного периода. Используемая для этих целей аналитическая методика должна быть охарактеризована в отношении пределов обнаружения измененной последовательности.

В зависимости от особенностей системы экспрессии оценка экспрессирующей конструкции может проводиться путём анализа как геномной ДНК, так и мРНК или кДНК, а также материала, амплифицированного в полимеразной цепной реакции.

Анализ нуклеотидной последовательности необходим, поскольку методы анализа белков не всегда позволяют обнаружить все изменения в структуре белка, возникающие в результате мутаций.

Единого экспериментального подхода, который мог бы обнаружить все возможные изменения в белке, не существует. Методы анализа белка могут включать определение аминокислотной последовательности, структурных особенностей, возникающих в результате посттрансляционных модификаций, таких как протеолиз, гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование.

Набор методов анализа нуклеиновой кислоты и белка должен быть обоснован и определяется в Досье для каждого продукта.

Производство

Экспрессирующая конструкция. Должны быть представлены следующие сведения:

- информация о линии клеток и векторах, используемых для получения штамма-продуцента, включая их источник, структуру и выбранные маркеры;

- происхождение нуклеотидной последовательности, кодирующей целевой белок, название и происхождение клетки, из которой изначально была получена нуклеотидная последовательность, описание методов получения ДНК, кодирующей целевой белок;

- происхождение составных частей экспрессирующей конструкции, например, точки начала репликации, гены устойчивости к антибиотикам, промоторы, энхансеры, является ли белок белком слияния;

- методы, используемые для введения вектора в клетку хозяина, отбор и клонирование трансформированных клеток, критерии отбора;

- состояние вектора внутри клетки хозяина;

- нуклеотидные последовательности интересующих генов и фланкирующих регуляторных областей векторов экспрессии. Должны быть указаны области, секвенированные в процессе конструирования, и области, последовательности которых указаны на основании данных литературы. Последовательности мест соединения составных частей экспрессирующей конструкции при использовании лигирования должны быть подтверждены секвенированием;

- материалы исследования, подтверждающие включение вектора в клетку хозяина, например, с использованием различных рестриктаз и методов саузерн-блот или норзерн-блот;

- метод индуцирования экспрессии соответствующего гена и контроля ее в процессе производства;

- идентификация всех экспрессирующих последовательностей;

- индикация любых модификаций;

- данные по оценке стабильности экспрессирующей конструкции. Стабильность генетических и фенотипических характеристик штамма-продуцента должна быть показана на материале, полученном до и после количества удвоений или количества пассажей клеток, ожидаемых при полномасштабном производстве. Данные должны включать сведения о проценте клеток, удерживающих экспрессирующую конструкцию, копийность гена, уровень экспрессии белка, характеристика рекомбинантного белка установленными методами и/или нуклеотидная последовательность гена (при использовании любого метода должен быть указан предел обнаружения отклонений от установленных параметров.

Система банков клеток. Для получения рекомбинантного белка должна использоваться система банков клеток, аттестованных в установленном порядке, обычно включающая Основной банк клеток (ОБК) и Рабочий банк клеток (РБК). Во время создания банка клеток не допускается одновременно работать с другими линиями клеток в тех же лабораторных помещениях или при участии одного и того же персонала, работающего с разными линиями клеток.

ОБК - гомогенная суспензия клеток хозяина, трансформированных экспрессионным вектором. Суспензию разливают в равных объемах в криопробирки, замораживают и хранят при температуре не выше минус 70°С. Рекомендуется создание также банка клеток хозяина и экспрессионного вектора.

ОБК является производным от отобранного клеточного клона, содержащего экспрессирующую конструкцию.

РБК - гомогенная суспензия клеток, полученных культивированием клеток из одной или более ампул ОБК, разлитая в равных объемах в криопробирки, которые хранятся в аналогичных условиях. РБК используют для производства каждой серии готового продукта. Образцы рабочего банка клеток необходимо хранить, как минимум, до истечения срока годности последней выпущенной партии продукта.

Аналогичная система банков должна быть предусмотрена для клеток хозяина.

Криопробирка с клетками используется только один раз. Повторное замораживание клеточного материала не допускается.

Сведения о банках клеток должны включать следующую информацию:

- детальное описание истории создания клеточной линии и получения банков клеток, включая методы и реагенты, использованные в процессе культивирования;

- возраст клеток in vitro, условия их хранения и стабильность;

- указание фенотипических и генетических маркеров;

- характеристика экспрессирующей конструкции:

- физическая (рестрикционная) карта экспрессирующей конструкции (вектора);

- число копий, наличие вставок или делеций, число мест интеграции методом картирования с помощью рестрикционных эндонуклеаз или других подходящих методик;

- процент клеток, удерживающих экспрессирующую конструкцию;

- нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантный белок. Для экстрахромосомных систем должна быть выделена экспрессирующая конструкция и нуклеотидная последовательность, кодирующая продукт, должна быть подтверждена без последующего клонирования. Для клеток с хромосомными копиями экспрессирующей конструкции нуклеотидная последовательность, кодирующая продукт, может быть проверена при помощи повторного клонирования и секвенирования хромосомных копий. В качестве альтернативы, нуклеотидная последовательность, кодирующая продукт, может быть проверена с помощью секвенирования материала, амплифицированного в полимеразной цепной реакции. С учетом предела обнаружения метода последовательность нуклеиновой кислоты должна быть идентична последовательности, установленной для экспрессирующей конструкции, и должна соответствовать планируемой аминокислотной последовательности белка. Нуклеотидная последовательность гена должна быть подтверждена не только на стадии посевного материала, но и на конечной стадии роста клеточной популяции при ферментации в производстве. При отсутствии возможности такого анализа (например, при непрерывном культивировании клеточных линий с мультикопийным геном) следует использовать анализ мРНК или метод блота тотальной ДНК. Подтверждением нуклеотидной последовательности экспрессирующей конструкции может быть уровень экспрессии и характеристика экспрессируемого белка.

- способ введения вектора в клетку хозяина;

- способы индукции и контроля уровня экспрессии.

- отсутствие в банке онкогенных и посторонних инфекционных агентов: вирусов, бактерий, грибов, микоплазм.

- отсутствие у клеточных линий онкогенности.

Если создается только РБК, исследования должны проводиться для каждого РБК.

Культивирование и сбор

Культивирование клеток и сбор продукта может быть выполнен одним из следующих способов.

Производство с однократным сбором продукта. Клетки культивируются до определенного числа пассажей или уровня удвоения популяции клеток, в соответствии с данными по стабильности клеточной линии. Продукт собирается единовременно.

Производство с многократным сбором продукта (непрерывное культивирование). Клетки культивируются непрерывно в течение определенного периода, установленного на основе данных по стабильности системы и постоянства качества продукта до и выше установленного предела. В течение всего периода культивирования клеток необходим мониторинг системы. Требуемая частота и тип мониторинга зависят от нескольких факторов, включающих природу системы экспрессии, а также общую продолжительность непрерывного культивирования.

Каждый сбор проверяется на содержание целевого белка, микробиологическую чистоту, наличие эндотоксинов и микоплазмы. Рутинный контроль на посторонние вирусы выполняется на определенном этапе в зависимости от производственной схемы и природы используемых материалов.

Критерии приемлемости сбора определяются установленной процедурой мониторинга.

Происхождение, описание, хранение, использование и стабильность в течение определенного времени хранения и использования клеток банка должно быть документировано в полном объеме.

Очистка

Сборы могут быть объединены перед началом процедуры очистки.

Процесс очистки должен включать стадии, позволяющие удалять и/или инактивировать оболочечные и безоболочечные вирусы. Процедуры удаления и/или инактивации инфекционных агентов и удаления примесей, связанных с продуктом или процессом производства, должны быть валидированы и обеспечивать постоянство качества и биологической активности продукта.

Если в процессе производства очищенные белки или другие промежуточные продукты подвергаются хранению, должны быть указаны сроки хранения каждого промежуточного продукта, подтвержденные данными о стабильности продукта в течение указанного времени, а также влияние условий хранения на качество и срок годности конечного продукта.

При валидации критических стадий производственного процесса следует документально подтвердить:

- удаление или снижение содержания чужеродных агентов, например, вирусов;

- удаление содержания ДНК и белков клетки хозяина до установленных пределов в конечном продукте;

- удаление гетерологичных белков и веществ, используемых при очистке (например, белков питательной среды, белков, использовавшихся в носителях для аффинной хроматографии, реагентов для центрифугирования в градиенте плотности и т.п.);

- стабильность полупродуктов на промежуточных стадиях производства в случае необходимости их хранения.

- Каждая партия очищенного белка, конечного балка, конечной серии продукта должны контролироваться в соответствии с установленными спецификациями.

Очищенный целевой белок

Набор методов контроля очищенных белков зависит от результатов валидации технологического процесса, постоянства качества и количества примесей, связанных с продуктом или процессом очистки. Очищенные белки должны оцениваться на подлинность, чистоту (специфические и неспецифические примеси, например продукты деструкции получаемого вещества и технологические примеси (см. ОФС "Фармацевтические субстанции"), специфическую активность, удельную активность (активность на единицу массы продукта), микробиологическую чистоту, бактериальные эндотоксины с использованием соответствующих методов и стандартных образцов. При необходимости в очищенных белках оценивают степень гликозилирования, содержание углеводов и липидов.

Для подтверждения подлинности получаемого продукта возможно:

- секвенирование N-концевой последовательности и определения С-концевых аминокислотных остатков

- пептидное картирование, с применением химического или ферментативного расщепления белка. Последующий анализ полученных пептидных фрагментов с помощью жидкостной хроматографии, в том числе с масс-спектрометрическим детектором, капиллярного электрофореза или двумерного гель-электрофореза должен показать отсутствие существенных различий испытуемого образца с образцом сравнения (международные стандартные образцы, стандартные образцы отечественной или зарубежных Фармакопей, отраслевые стандартные образцы, стандартные образцы предприятия).

Для оценки чистоты белка могут использоваться различные методы: химические (определение белка, углеводов, липидов и др.), физико-химические, такие как электрофорез в полиакриламидном геле с SDS в редуцирующих и нередуцирующих условиях, капиллярный электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, высокоэффективная хроматография, аминокислотный анализ, круговой дихроизм, углеводное картирование, а также иммунохимические методы - иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг. Выбор методов должен быть обоснован.

Чистота белка должна быть не менее 95%.

Испытания

Конечный балк

Конечный балк готовят из одной или нескольких партий очищенных белков. В процессе приготовления конечного балка вносят стабилизирующие агенты и другие вспомогательные вещества.

Для производства конечной серии продукта может быть использован конечный балк, удовлетворяющий требованиям спецификации, в которой должны быть предусмотрены следующие требования. Если после добавления стабилизирующих агентов и вспомогательных веществ какой-либо показатель не может быть определен, его контроль должен проводиться на очищенном продукте.

- Подлинность. Подлинность может быть определена с помощью пептидного картирования, а также различных методов, включая электрофорез в полиакриламидном геле, капиллярный электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, ионообменную или обращено-фазную хроматографию с использованием стандартных образцов. Для оценки подлинности также может использоваться метод определения специфической активности.

- Стерильность. Конечный балк должен быть стерильным. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Стерильность".

- Бактериальные эндотоксины. Содержание бактериальных эндотоксинов должно соответствовать нормам, определенным в частной фармакопейной статье. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Бактериальные эндотоксины".

- Чистота. Специфические и посторонние примеси, связанные с процессом производства. Специфические и неспецифические примеси оценивают на стадии получения очищенного белка, если анализ не может быть выполнен на конечном балке.

Препараты должны быть охарактеризованы по содержанию основного компонента (не менее 95%) и модифицированных форм белка (окисленных, деаминированных, укороченных). Определение проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле с SDS в редуцирующих и нередуцирующих условиях, методом капиллярного электрофореза, методом изофокусирования или методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием стандартных образцов.

Тесты для определения содержания белков клеток-хозяина, векторной ДНК и ДНК клеток-хозяина, а также иных посторонних примесей, связанных с процессом производства, проводятся на достаточном количестве партий очищенного белка или серий конечного балка (не менее 5). Конечный балк должен соответствовать нормам, установленным в частной фармакопейной статье и должен выдерживать испытания на содержание остаточной ДНК (не более 10 нг на дозу) и белков штаммов-продуцентов (не более 0,1% общего белка) по методикам, приведенным в частной фармакопейной статье.

Данные тесты могут проводиться не для каждой партии белка или серии балка, если имеется документально подтвержденное постоянство процедуры очистки.

Остаточные белки штамма-продуцента могут быть определены иммунохимическими методами (радиоиммунологическим, иммунохимическим - ИФА). Для получения антигена, используемого как для последующей наработки поликлональных антител к белкам штамма-продуцента, так и для построения калибровочного графика, следует использовать следующую процедуру. Клетки хозяина трансформируются используемым в штамме-продуценте вектором, не содержащим ген, кодирующий целевой продукт. Эти клетки культивируются, и подвергаются процедуре выделения и очистки. Количество стадий очистки определяется производителем. Из очищенных клеток получают антиген, который представляет собой смесь белков. Следует провести их количественное определение подходящим методом и хранить в условиях, обеспечивающих их стабильность в течение продолжительного времени. Иммунохимические методы для определения остаточных белков штамма-продуцента должны отвечать следующим требованиям.

Антиген должен представлять максимально возможное количество белков - антигенов.

Поликлональные антитела, вырабатываемые на полученный таким образом антиген, должны связывать максимально возможное количество белков - антигенов и не давать перекрестного связывания с целевым продуктом.

Оценку результатов проводят, сравнивая данные тестирования испытуемого образца с калибровочным графиком, полученным при тестировании антигена.

Для определения остаточных белков штамма-продуцента, возможно использования зарегистрированных реагентов.

Остаточная ДНК штамма-продуцента может быть определена методом гибридизации с биотин или дигоксигенин-меченными зондами;

Для получения стандартной пробы проводят выделение хромосомной и векторной (плазмидной) ДНК штамма-продуцента. Количественное содержание ДНК в стандартных пробах проводят спектрофотометрически. При проведении анализа следует убедиться, что продукт, полученный в результате производственного процесса, не влияет на определение ДНК.

Оценку результатов проводят, сравнивая данные тестирования испытуемого образца с данными, полученными при тестировании стандартных проб хромосомной и векторной ДНК штамма-продуцента.

Возможно определение остаточной ДНК штамма-продуцента методами, не зависимыми от связывания со специфической нуклеотидной последовательностью. К ним относятся:

- связывание ДНК с мечеными антителами к ДНК и последующая реакция полученного комплекса с антителом к этому белку (Threschold);

- непосредственное связывание ДНК с флуоресцентным красителем.

Метод, использующийся для определения остаточной ДНК штамма-продуцента должен быть охарактеризован по специфичности, пределу обнаружения и прецизионности.

Готовый продукт

Для получения готового продукта конечный балк разливают в асептических условиях в стерильные емкости, которые затем закрывают, обеспечивая герметичность для предотвращения микробной контаминации.

В спецификации на готовый продукт должны быть предусмотрены следующие требования.

Описание. Препараты в жидкой или восстановленной лиофилизированной лекарственной форме должны представлять прозрачный или слегка опалесцирующий бесцветный или желтоватым оттенком раствор без видимых частиц.

Подлинность. В зависимости от природы белка, подлинность может быть определена с помощью различных методов, включая электрофорез в полиакриламидном геле, капиллярный электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, ионообменную или обращено-фазную хроматографию с использованием стандартных образцов. Для оценки подлинности также может использоваться метод определения специфической активности.

Прозрачность. Прозрачный или слегка опалесцирующий раствор (если нет других указаний в частной фармакопейной статье), указывают метода определения. Определение проводят в соответствии с ОФС "Прозрачность и степень мутности жидкостей".

Цветность. Бесцветный или с желтоватым оттенком раствор (если нет других указаний в частной фармакопейной статье). Испытание проводят в соответствии с ОФС "Степень окраски жидкостей".

В разделе "Цветность" или "Цветность восстановленного раствора" указывают требования к цветности препарата или раствора, полученного при использовании растворителя, определенного инструкцией по применению, методы определения и оценки данных показателей.

Время растворение (для лиофилизированных препаратов). Не более 5 мин, если в частной фармакопейной статье нет других указаний.

Препараты в лиофилизированной форме должны полностью растворяться в указанном объеме восстанавливающей жидкости в течение определенного времени. Объем, состав восстанавливающей жидкости, время растворения указывают в частной фармакопейной статье. Восстановленный раствор - прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость без видимых частиц.

рН. Значения и допустимые пределы указывают в частной фармакопейной статье. Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Потеря в массе при высушивании (для лиофилизированных препаратов). Не более 3%.

Определение проводят гравиметрическим методом в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании".

Вода. Методику и предельно допустимое содержание воды в лиофилизированных препаратах указывают в частной фармакопейной статье.

Извлекаемый объем. Извлекаемый объем должен соответствовать требованиям, указанным в частных фармакопейных статьях и должен быть не менее номинального. Определение проводят по ОФС "Извлекаемый объем для лекарственных форм для парентерального применения".

Механические включения. Определение проводят в соответствии с ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

Общий белок. Общее содержание белка определяют по ОФС "Определение белка" или другим валидированным методом.

Методику, значение и допустимые пределы указывают в частной фармакопейной статье.

Распределение по молекулярной массе. Распределение по молекулярной массе определяют методом эксклюзионной хроматографии, гельфильтрации или другими валидированными методами.

Значение и допустимые пределы указывают в частной фармакопейной статье.

Чистота. Содержание основного компонента должно быть не менее 95%. Определение проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле с SDS в редуцирующих и нередуцирующих условиях, методом капиллярного электрофореза или методом обращено-фазной хроматографии с использованием стандартных образцов.

Если анализ не может быть проведен в готовой продукции, специфические и неспецифические примеси оценивают на стадии получения очищенного белка. Препараты должны быть охарактеризованы по содержанию модифицированных форм белка (окисленных, деаминированных, укороченных), должны выдерживать испытания на содержание остаточной ДНК (не более 10 нг на дозу), белков штаммов-продуцентов (не более 0,1% общего белка) и другие примеси по методикам, приведенным в частной фармакопейной статье.

Специфическая активность. Специфическую активность оценивают соответствующими методиками, указанными в частной фармакопейной статье, с использованием стандартных образцов.

Стерильность. Должен быть стерильным. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Стерильность".

Пирогенность или бактериальные эндотоксины. Должен быть апирогенным и не должен содержать бактериальные эндотоксины. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность" или ОФС "Бактериальные эндотоксины".

Требования к пробоподготовке препарата, тест-дозе в весовых, объемных или других единицах указывают в частной фармакопейной статье.

Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным. Определение проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность". Требования к пробоподготовке препарата, тест-дозе в весовых, объемных или других единицах указывают в частной фармакопейной статье. Срок наблюдения за животными 7 сут.

Вспомогательные вещества. При наличии в составе препарата вспомогательных веществ (стабилизаторы, консерванты и др.) методику определения и допустимые пределы указывают в частной фармакопейной статье.

Упаковка и Маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".

Транспортирование и хранение. В защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С (если в частной фармакопейной статье нет других указаний). Жидкие лекарственные средства не допускается замораживать.

Срок годности. Дата срока годности определяется датой стерилизующей фильтрации и розлива для жидких лекарственных форм или датой лиофилизации для лиофилизированных лекарственных форм.