Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина бруцеллезная живая"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина бруцеллезная живая"

Вводится впервые

Вакцина бруцеллезная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для подкожного введения и накожного скарификационного нанесения представляет собой культуру живых микробов бруцеллезного вакцинного штамма Brucella abortus 19 BА, высушенную методом лиофилизации в стабилизирующей среде. Вакцина предназначена для профилактики бруцеллеза и обеспечивает развитие иммунитета продолжительностью 10-12 месяцев, с сохранением максимальной напряженности иммунитета в течение 5-6 месяцев.

Особенности производства.

Вакцинный штамм Brucella abortus 19 BА, биовар I, должен обладать типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами; агглютинироваться сывороткой бруцеллезной поливалентной диагностической для РА до ее титра, с образованием стойкого крупнохлопчатого агглютината; не обнаруживать признаков диссоциации в пробе с трипофлавином, не должен содержать бактериофага; "остаточная вирулентность" для белых мышей массой  г должна быть в пределах от до микробных клеток (м.к.); не должен вызывать гибели белых мышей при введении дозы равной  м.к; предохранять от заражения двумя минимальными заражающими дозами вирулентного штамма Brucella melitensis 565 не менее 8 из 10 морских свинок, привитых подкожно живых бруцелл в 1 мл.

Перед приготовлением производственной культуры Brucella abortus 19 BА проводят его пассаж через организм морской свинки с последующим отбором типичных колоний, выросших на плотной питательной среде из посевов селезенки или регионарных лимфатических узлов.

Технология производства вакцины бруцеллезной живой, предусматривает получение посевных культур B. abortus 19 BА I, II, III и IV генераций, процесса накопления биомассы, выращенной для приготовления микробной взвеси с необходимой концентрацией с последующим розливом, замораживанием, сублимационным высушиванием, герметизацией и упаковкой препарата.

В зависимости от технологии приготовления вакцины в процессе производства используются стабилизаторы, разрешенные для медицинского применения: сахароза, желатин, тиомочевина, натрия глютамат.

На стадиях приготовления посевных культур определяют рН, концентрацию микробных клеток, отсутствие посторонней микрофлоры, проводят контроль посевных культур на диссоциацию, отсутствие бактериофага и дифференциацию по редуцирующей способности бруцелл к анилиновым краскам.

Испытание готового продукта

Описание. Пористая масса серовато-белого или серовато-белого с желтоватым оттенком цвета.

Подлинность. Должна содержать чистую культуру вакцинного штамма бруцеллезного микроба. Определение проводят иммунофлуоресцентным методом с помощью иммуноглобулинов флуоресцирующих бруцеллезных в соответствии с инструкцией по применению. В мазках из препарата должно наблюдаться специфическое ярко-зеленое свечение по периферии микробных клеток.

Время растворения. Должна полностью растворяться в течение 1 мин при добавлении 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида.

Растворенный препарат - гомогенная мутная суспензия серовато-белого или серовато-белого с желтоватым оттенком цвета без посторонних примесей, осадка или хлопьев. Определяют визуально.

рН. От 6,8 до 7,2. Определяют потенциометрически в соответствии с ОФС "Ионометрия". Для испытания используют 20 ампул, содержимое каждой ампулы растворяют в 1 мл воды для инъекций.

Время седиментационной устойчивости. Суспензия должна быть устойчива в течение 5 мин.

Размер частиц. Суспензия должна проходить в шприц через иглу N 0840. Определение проводят в соответствие с ОФС "Инъекционные лекарственные формы".

Потеря в массе при высушивании. Не более 3%. Определение проводят в соответствии с требованиями ОФС "Потеря в массе при высушивании". Для испытания используют содержимое 6 образцов.

Средняя масса и отклонение от средней массы. Коэффициент вариации массы вакцины в ампулах должен быть не более 5%. Определение проводят весовым методом. 10 образцов без этикеток обрабатывают смесью спирта с эфиром и помещают в эксикатор на 3 ч. Ампулы вскрывают, взвешивают вместе с препаратом, затем удаляют содержимое и промывают водой. После этого ампулы выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100-105°С до постоянной массы. По разности масс ампул с содержимым и без него находят массу вещества и рассчитывают коэффициент вариации (V) в процентах по формуле:

,где

S - стандартное отклонение;

- среднее арифметическое значение массы вещества в ампуле;

X - масса вещества в каждой ампуле;

n - число ампул.

Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов. Вакцина не должна содержать посторонних микроорганизмов и грибов. Вакцина должна представлять чистую живую культуру вакцинного штамма бруцеллезного микроба. Определение проводят в соответствии с ОФС "Стерильность" методом прямого посева на тиогликолевой среде.

За один образец принимают содержимое 2 ампул с препаратом. В ампулы вносят по 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида, перемешивают и по 1 мл каждого образца высевают в пробирки, содержащие по 20 мл тиогликолевой среды. Одну пробирку из каждого образца инкубируют при температуре от 30 до 35°С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, а другую - при температуре от 20 до 25°С для выявления грибов. Через 5-7 сут из каждой пробирки производят пересев по 0,5 мл на 2 пробирки, содержащие 10 мл тиогликолевой среды. Все пробирки выдерживают после пересева при соответствующих температурных режимах до 14 сут со дня первичного посева. Через 14 сут из всех пробирок делают мазки, окрашивают по Граму, просматривают под микроскопом при увеличении 90х10.

В случае обнаружения хотя бы в одном из 10 просмотренных полей зрения кокков или грамположительных микроорганизмов, препарат считается контаминированным посторонней микрофлорой.

При выявлении в мазках грамотрицательных палочек, отличающихся по морфологии от бруцеллезного микроба из этого образца готовят 3 мазка, которые окрашивают иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими бруцеллезными сухими и просматривают в каждом мазке не менее 10 полей зрения под фазовоконтрастным и люминесцентным микроскопами. Если не все микробные клетки, обнаруживаемые под фазовым контрастом, окрашиваются специфически (ярко-зеленое свечение по периферии клеток), образец считают загрязненным посторонней микрофлорой. В этом случае контроль повторяют на удвоенном количестве образцов. В случае роста посторонней микрофлоры при повторном посеве хотя бы в одной пробирке препарат считают не выдержавшим испытание.

Специфическая безопасность. Вакцина должна быть безопасной. Вакцина, введенная подкожно в дозе  м.к. белым мышам не должна вызывать их гибель в течение 6 сут наблюдения.

В ампулу вносят 0,9% раствор натрия хлорида в объеме, обеспечивающем содержание  м.к. в 1 мл. Полученную микробную взвесь вводят подкожно 5 белым мышам массой  г в объеме 0,5 мл во внутреннюю поверхность бедра.

Если погибла хотя бы одна мышь, испытание повторяют на удвоенном количестве животных. Если при повторном контроле наблюдается гибель хотя бы одного животного, препарат считают не выдержавшим испытание.

Специфическая активность.

1. Концентрация микробных клеток (ОК).

В препарате должно содержаться бруцелл в 1 мл. Концентрацию микробных клеток определяют в трех образцах. В ампулу с препаратом вносят по 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида, перемешивают до получения равномерной суспензии. 0,1 мл разведенного препарата вносят в пробирки и мерно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида до достижения ОСО мутности 42-28-85П (10 МЕ) соответствующего года выпуска. Концентрацию м. к. определяют по формуле:

, где:

0,1 - объем растворенной вакцины, мл;

n - объем 0,9% раствора натрия хлорида, использованное при разведении пробы, мл;

10 - постоянная величина;

- концентрация м.к./мл для бруцелл по ОСО мутности 42-28-85П (10 МЕ) соответствующего года выпуска.

2. Количество живых микробных клеток.

Количество живых микробных клеток должно составлять не менее 60% от общего количества микробных клеток. Колебания результатов определений в отдельных ампулах серии не должны превышать 20% от средней арифметической величины.

При определении содержания живых микробных клеток в вакцине используют концевые химически чистые пипетки и пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида, которые должны быть охлаждены до температуры °С.

Определение проводят раздельно в трех ампулах. Содержимое каждой ампулы разводят в 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида, делают последовательные десятикратные разведения от до , используя для каждого разведения отдельную пипетку вместимостью 1 мл. Из разведений и высевают по 0,1 мл взвеси раздельно для каждого образца на 3 чашки Петри с эритрит-агаром или мясным питательным агаром.

Испытание осуществляют одновременно с определением количества живых микробных клеток в стандартном образце вакцины бруцеллезной живой.

За количество живых микробных клеток принимают среднюю арифметическую определений количества живых клеток в трех ампулах.

После инкубации посевов в течение 5 сут при температуре °C подсчитывают число выросших колоний, вычисляют среднее количество колоний для каждого разведения. К полученному числу добавляют количество нулей, равное показателю степени взятого разведения, суммируют и делят на количество посеянных разведений, т.е. на 2. Данное число увеличивают в 10 раз и получают количество живых бруцелл, содержащихся в 1 мл вакцины.

Процент выросших колоний вычисляют для каждой ампулы, принимая за 100% число микробных клеток, исходя из показателя концентрации для данной ампулы.

Процент живых микробных клеток вычисляют по формуле:

, где

БК - количество живых м.к. в 1 мл;

ОК - общая концентрация м.к.

Количество накожных доз. В ампуле должно содержаться от 4 до 10 накожных доз. Количество прививочных доз в ампуле устанавливается путем деления среднего (по трем ампулам) количества живых микробов в 1 мл на 10^10 м.к., составляющих одну накожную прививочную дозу.

Иммуногенность. Не менее 7 из 10 морских свинок, привитых подкожно дозой живых бруцелл в 1 мл, должны быть предохранены от заражения двумя минимальными заражающими дозами вирулентного штамма B. melitensis 565. Одна минимальная заражающая доза B. melitensis 565 не должна превышать 10 м.к.

10 морских свинок массой  г любого пола иммунизируют подкожно дозой живых м. к. в объеме 1 мл вакцины. Через 28-30 сут иммунизированных и 3 неиммунизированных (контрольных) животных заражают подкожно введением двух инфицирующих доз в объеме 1 мл. Параллельно проверяют количество живых м.к. вирулентного штамма в дозе для заражения путем посева из разведения по 0,1 мл на 3 чашки Петри с питательным агаром. Через 6-7 сут инкубации посевов при температуре °С на каждой чашке должно вырасти не менее 2 колоний.

Иммунизированных и контрольных морских свинок через 28-30 сут подвергают эвтаназии и вскрывают. Печень, селезенку, лимфоузлы (паховые, парааортальные, шейные) помещают в стерильную чашку Петри. Каждый орган надсекают ножницами, берут уколом стерильной деревянной палочкой и вносят в пробирку со скошенным печеночным агаром или агаром Альбими, тщательно втирая материал в поверхность агара. Затем посевной материал вносят в пробирки с эритрит-бульоном.

Выросшие колонии бруцелл петлей высевают на среды с анилиновыми красками. Через 7 сут инкубации посевов при температуре °С выделенные культуры дифференцируют по редуцирующей способности бруцелл к анилиновым краскам и образованию сероводорода. B. abortus растет только на средах с фуксином, B. melitensis - в присутствии фуксина и тионина.

При росте культуры только в бульоне, ее пересевают на агар и затем дифференцируют.

Не менее чем у 7 морских свинок, иммунизированных вакциной, при высевах из органов не должно быть роста B. melitensis. У всех неиммунизированных (контрольных) морских свинок должно быть обнаружено заражение, т.е. выделение B. melitensis из паренхиматозных органов (печень, селезенка) и лимфоузлов. В случае если вакцина защищает меньшее количество морских свинок, опыт повторяют по той же методике и на том же количестве животных в сравнении со стандартным образцом вакцины бруцеллезной живой. Если при повторном контроле стандартный образец предохраняет от заражения при введении двух минимальных доз вирулентного штамма B. melitensis 565 не менее, чем 7 из 10 иммунизированных свинок, а испытуемая - меньшее количество морских свинок, препарат считают не выдержавшим испытание.

Термостабильность. Показатель термостабильности должен быть не менее 7 сут. Определение проводят через 14 сут хранения препарата при температуре °С, используя три образца.

В препарате должно сохраняться 50% живых микробных клеток по отношению к первоначальному числу при температуре хранения °C. Методика определения количества живых микробных клеток изложена в разделе "Специфическая активность", "Процент живых клеток".

Показатель термостабильности рассчитывают по формуле:

, где

t - показатель термостабильности в сут;

- логарифм первоначального числа живых м.к./мл;

- логарифм числа живых м.к./мл через 14 сут хранения вакцины при температуре °C;

0,3 - постоянная величина;

14 - срок хранения вакцины при температуре °C в сут.

Маркировка и упаковка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".