Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина сибиреязвенная комбинированная"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина сибиреязвенная комбинированная"

Вводится впервые

Вакцина сибиреязвенная комбинированная, лиофилизат для приготовления суспензии для подкожного введения представляет собой лиофилизированную в стабилизирующей среде смесь взвеси живых спор вакцинного штамма Bacillus anthracis СТИ-1 и очищенного концентрированного протективного сибиреязвенного антигена (ПА), адсорбированного на алюминия гидроксиде. Вакцина предназначена для профилактики сибирской язвы и обеспечивает формирование специфического иммунитета продолжительностью до 1 года.

Особенности производства

Вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1 должен иметь типичные культурально-морфологические, биохимические и генетические свойства; должен обладать остаточной вирулентностью для морских свинок при введении 50 млн. спор и белых мышей - 10 млн. спор; быть специфически безопасным для кроликов при введении им спор; индекс иммунитета для морских свинок должен быть не ниже 10000.

Перед приготовлением очередной серии вакцинного штамма проводят его анимализацию путем пассажа через организм морской свинки, с последующим отбором типичных колоний, выросших на плотной питательной среде при посеве селезенки.

Технология изготовления вакцины сибиреязвенной комбинированной состоит из получения посевной культуры B. anthracis СТИ-1; глубинного культивирования посевной культуры B. anthracis СТИ-1 для получения нативной споровой культуры; приготовление концентрированной споровой взвеси; приготовления концентрированного протективного антигена (ПА) методом сепарирования нативной культуры штамма B. anthracis СТИ-1 с последующим концентрированием и стерилизующей фильтрацией на установках ультрафильтрации или методом микрофильтрации; сорбции концентрированного ПА на алюминия гидроксиде; стабилизации сорбированного ПА формальдегидом с последующей отмывкой 0,9% раствором натрия хлорида; смешивания сорбированного концентрированного ПА с концентратом споровой культуры B. anthracis СТИ-1 с последующим розливом, замораживанием, сублимационным высушиванием, герметизацией и упаковкой препарата. В качестве стабилизатора используется вещество, разрешенное к медицинскому применению - сахароза.

На стадиях приготовления посевной и нативных культур определяют рН, концентрацию спор, отсутствие посторонней микрофлоры. Качество протективного антигена определяют по следующим показателям: стерильность, рН, содержание общего азота, алюминия гидроксида и формальдегида.

Испытание готового продукта

Описание. Пористая масса серовато-белого цвета.

Подлинность. Определение подлинности вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 проводят микроскопическим методом. В мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену, должны наблюдаться овальные споры розового цвета с красным ободком по периферии.

Определение подлинности протективного антигена (ПА) проводят иммунохимическим методом в реакции диффузионной преципитации (РДП) с иммуноглобулином противосибиреязвенным лошадиным. Методика изложена в разделе "Специфическая активность".

Время растворения. Должна полностью растворяться течение 5 мин в 5 мл 0,9% раствора натрия хлорида при встряхивании. Растворенный препарат - гомогенная суспензия серовато-бежевого цвета без посторонних примесей и включений.

Время седиментационной устойчивости. Суспензия не должна расслаиваться в течение не менее 5 мин. Определение проводят в соответствии ОФС "Инъекционные лекарственные формы".

Размер частиц. Суспензия должна свободно проходить в шприц через иглу N 0840. Определение проводят в соответствии ОФС "Инъекционные лекарственные формы".

рН. От 7,1 до 7,3. Определение проводят потенциометрически в соответствии с ОФС "Ионометрия". Для испытания используют содержимое 5 ампул препарата, разведенного в 25 мл 0,9% раствора натрия хлорида рН 7.1_0.1.

Средняя масса и отклонения от средней массы. Коэффициент вариации массы вакцины в ампулах должен быть не более 5%. Определение проводят весовым методом. 10 образцов без этикеток обрабатывают смесью спирта с эфиром и помещают в эксикатор на 3 ч. Ампулы вскрывают, взвешивают вместе с препаратом, затем удаляют содержимое и промывают водой. После этого ампулы выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100-105°С до постоянной массы. По разности масс ампул с содержимым и без него находят массу вещества и рассчитывают коэффициент вариации (V) в процентах по формуле:

, где

S - стандартное отклонение;

- среднее арифметическое значение массы вещества в ампуле;

X - масса вещества в каждой ампуле;

n - число ампул.

Потеря в массе при высушивании. Не более 5%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании".

Общий азот. Не более 0,4 мг/мл. Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение общего азота с реактивом Несслера".

Ионы алюминия. Не более 2,7 мг/мл. Определение проводят в соответствии с ОФС "Комплексометрическое титрование. Определение ионов алюминия в сорбированных иммунобиологических препарата".

Формальдегид. Не более 0,001%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение формальдегида".

Полнота сорбции антигена. Надосадочная жидкость должна содержать не более 25 ЕА/мл (единиц активности в мл). Содержимое ампулы ресуспендируют в 5 мл 0,9% растворе натрия хлорида, перемешивают и отделяют осадок центрифигированием при 2000 g в течение 30 мин. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и разводят в 2, 4 и 8 раз 0,2 М фосфатным буферным раствором рН . Определение полноты сорбции антигена проводят в РДП в агаре по методу Оухтерлони с иммуноглобулином противосибиреязвенным лошадиным. Приготовление агара, постановку реакции и расчет результатов анализа проводят в соответствии с разделом "Специфическая активность".

Полноту сорбции оценивают по максимальному разведению супернатанта, при котором еще образуется видимая линия преципитации с иммуноглобулином противосибиреязвенным и выражают в единицах активности, содержащихся в 1 мл (ЕА/мл).

Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов.

Вакцина не должна содержать посторонних микроорганизмов и грибов. Определение проводят в соответствии с ФС "Вакцина сибиреязвенная живая".

Специфическая безопасность. Вакцина должна быть безопасной. Вакцину растворяют в 5 мл 0,9% натрия хлорида для инъекций. Испытание проводят в соответствии с ФС "Вакцина сибиреязвенная живая". Животным вводят вакцину подкожно в область внутренней поверхности каждого бедра в объеме 1,25 мл (общий объем - 2,5 мл).

Специфическая активность.

1. Количество живых спор. Процент живых спор на плотной питательной среде должен составлять не менее 30 от расчетной концентрации. В 1 мл препарата после ресуспендирования расчетная концентрация составляет  млн. спор B. anthracis СТИ-1.

В каждую из трех первичных упаковок вносят 5 мл дистиллированной воды, встряхивают до образования гомогенной взвеси. Далее определение проводят в соответствии с ФС "Вакцина сибиреязвенная живая".

2. Активность протективного антигена (ПА). Активность ПА должна быть не менее 50 ЕА/мл.

Определение проводят в реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаре по методу Оухтерлони с иммуноглобулином противосибиреязвенным лошадиным. Для приготовления агара к 1 л фосфатного буферного раствора рН 7.8_0.1 добавляют 1% агара, 1% желатина и 0,25% фенола. Агар стерилизуют 15 мин при температуре (115_2) °С и в горячем виде осветляют центрифугированием при 2000 g в течение 5 мин. Готовый агар разливают в чашки Петри, помещенные на строго горизонтальную поверхность, слоем толщиной 6 мм. Штампом-пробойником вырезают одну центральную и шесть радиальных лунок, расстояние между центрами которых составляет 10 мм. Агар из лунок удаляют.

Вакцину последовательно разводят 0,2 М фосфатным буферным раствором рН 6,8_0,1 до разведений 1:2, 1:4, 1:6, 1:8. В центральную лунку вносят 0,04 мл цельного иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного, а в радиальные лунки по часовой стрелке - все разведения вакцины, начиная с цельного. Чашки помещают в эксикатор, содержащий дистиллированную воду, при температуре (19_1) °С в течение 3 сут. Предварительный учет результатов проводят через 24 ч, окончательный - на 3 сут.

Активность ПА оценивают по максимальному разведению вакцины, при котором образуется видимая линия преципитации с иммуноглобулином противосибиреязвенным и выражают в единицах активности (ЕА/мл).

Расчет проводят по формуле:

,

где: А - активность ПА в вакцине, ЕА/мл;

T - разведение вакцины, при котором наблюдается видимая линия преципитации;

V - объем пробы, внесенный в лунку (0,04 мл).

 3. Иммуногенность для морских свинок. Индекс иммунитета должен быть не менее 25000 (отношение величины заражающего тест-штамма B. anthracis 71/12 для иммунизированных животных к величине для неиммунизированных животных). В 4 образца с вакциной вносят по 5 мл 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций, встряхивают до образования гомогенной взвеси. Иммунизирующую дозу в объеме 0,5 мл вводят морским свинкам подкожно в область внутренней поверхности бедра. Далее определение проводят в соответствии с ФС "Вакцина сибиреязвенная живая".

4. Иммуногенность для кроликов. Препарат должен предохранять от гибели не менее 8 из 10 кроликов, привитых подкожно одной человеко-дозой вакцины, при подкожном инфицировании 100 вирулентного штамма сибиреязвенного микроба.

Испытание проводят на кроликах обоего пола массой (2.25_0.25) кг. Животных иммунизируют однократно подкожно в область внутренней поверхности бедра в объеме 0,5 мл (одна человеко-доза вакцины).

Перед инфицированием иммунизированных животных для определения культуры B. anthracis Ч-7 интактных кроликов инфицируют дозами и спор. Каждую дозу вводят не менее, чем 3 кроликам подкожно в паховую область задней конечности в объеме 1 мл. Наблюдение за животными проводят в течение 10 сут. Рассчитывают по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина.

Через 10 сут 10 иммунизированных и 3 контрольных кроликов заражают 100 споровой культурой B. anthracis Ч-7. Наблюдение за животными проводят в течение 10 сут. У павших животных проводят посев 0,1 мл крови, взятой из сердца трупа животного, на чашку Петри с агаром Хоттингера рН 7,1_0,1. Сибиреязвенную инфекцию подтверждают в случае характерного для сибиреязвенного микроба роста. Зараженные контрольные кролики должны погибнуть в течение 3 сут.

Растворители, выпускаемые в комплекте с препаратом. 0,9% раствор натрия хлорида.

Маркировка и упаковка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".