Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42 "Требования к штаммам микроорганизмов, используемые для производства пробиотиков для медицинского применения"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42
"Требования к штаммам микроорганизмов, используемые для производства пробиотиков для медицинского применения"

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на штаммы микроорганизмов, используемые для производства пробиотиков для медицинского применения. Для производства пробиотиков для медицинского применения используют производственные штаммы микроорганизмов с подтвержденным клиническим терапевтическим действием, депонированные в национальной или международной коллекции.

В ОФС изложены требования к отбору, проверке и хранению рекомендуемых штаммов микроорганизмов (система предрегистрационного доклинического изучения безопасности рекомендуемых штаммов), требования к системе надзора за производственными и посевными культурами, используемыми при производстве пробиотиков, требования к биологическим свойствам тест-штаммов микроорганизмов, рекомендуемых для контроля антагонистической активности производственных штаммов и готовых лекарственных форм пробиотиков.

Общая часть

Дифференциация и идентификация бактерий - определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизмов - наиболее ответственный этап микробиологического исследования. Он осуществляется на основании изучения комплекса свойств микроорганизмов: фенотипических и генотипических.

Фенотип - совокупность внешних признаков организма.

Генотип - совокупность генов определенного организма.

Организмы, обладающие одинаковыми генотипами, в разных условиях могут отличаться по фенотипу, т.е. может наблюдаться некоторое разнообразие фенотипов.

Определяется ряд фенотипических признаков: морфологические, тинкториальные, культуральные, специфические ферментативные свойства, антигенные особенности, спектр чувствительности к антибиотикам, фагам и бактериоцинам, а также генотип: определение нуклеотидного состава ДНК и содержание ГЦ-пар в ДНК, уровень гомологии ДНК, профиль плазмидной ДНК, электрофоретип, степень вирулентности, патогенности.

Классически идентификацию штаммов по генотипическим признакам проводят на основе данных ДНК - ДНК-гибридизации и содержания Г + Ц пар оснований ДНК. В настоящее время приемлемым способом является ПЦР-анализ с видо- и типоспецифическими праймерами для генов 16SpPHK, выявляющих нуклеотидные консервативные последовательности исследуемых микроорганизмов.

При характеристике микроорганизмов следует использовать генетические и фенотипические методы, позволяющие сравнивать последовательности генов и признаков с музейными штаммами национальных или международных коллекций и выявлять их молекуляроно-генетический полиморфизм.

Для дифференцирования патогенных и апатогенных штаммов внутри вида информативным является обнаружение в составе ДНК бактериальной клетки геномных "островков" патогенности. Повышенная их лабильность связана с тем, что они могут входить в состав транспозонов, плазмид и включаться в геном бактериофагов, формируя у разных непатогенных видов бактерий вирулентность.

Исследования должны быть выполнены в аккредитованной лаборатории с использованием современного оборудования и технологий.

К пробиотическим производственным штаммам предъявляются следующие требования:

1. Предлагаемый штамм должен быть идентифицирован до вида по фено- и генотипическим признакам и по профилю плазмидной ДНК. Штамм, имеющий R-плазмиды, транспозоны, бактериофаги, не может быть использован при производстве пробиотиков. При обнаружении других плазмид следует представить материалы по характеристике их функциональных свойств. При устойчивости штамма к антибиотикам она должна быть обусловлена хромосомной природой.

2. Генетически модифицированные микроорганизмы должны стабильно экспрессировать клонированные целевые гены и при многократном пассировании на культуре клеток или при введении лабораторным животным, должны сохранять исходные биологические свойства. Должны быть установлены отсутствие неконтролируемой передачи клонированной ДНК "новым хозяинам" и невозможность широкого распространения плазмиды, вследствием чего возможно нарушение микробной экосистемы, т.е. их биобезопасность. Рекомбинантная ДНК, используемая для получения генетически модифицированных штаммов микроорганизмов, не должна содержать маркеров антибиотикорезистентности.

3. Штамм, независимо от вида и рода, должен обладать однородными морфологическими, тинкториальными, культуральными свойствами без признаков диссоциации. Не допускается наличие слизистых колоний и капсул - признаков патогенности культур. Штамм с неясной характеристикой не может использоваться для производственных целей (Раздел 1).

4. Штамм должен быть однороден по физиолого-биохимическим свойствам, охарактеризованным с помощью регламентированных методов или с использованием зарегистрированных тест-систем. Штаммы с неясной биохимической характеристикой не могут быть рекомендованы в качестве производственных (Раздел 1).

5. Штамм не должен продуцировать ферменты, относящиеся к факторам патогенности, напр., каталазу, гиалуронидазу, фибринолизин, плазмокоагулазу, гемолизин, летициназу C, нейраминидазу и др. (Раздел 1).

6. Штамм должен обладать антагонистической активностью по отношению к клиническим свежевыделенным патогенным и условно-патогенным бактериям, к регламентируемым тест-штаммам. Зона угнетения роста тест-культур должна быть более 10 мм (Раздел 2).

Исследование осуществляют в соответствии с ОФС "Определение специфической активности пробиотиков для медицинского применения", набор тест-штаммов указывается в частной фармакопейной статье.

7. Штамм не должен обладать высокими адгезивными свойствами (Раздел 3).

8. Штамм не должен быть чувствительным к воздействию желудочного сока, щелочи, желчи (Раздел 1).

9. Штамм должен быть охарактеризован по способности продуцировать биологически активные вещества (например, ферменты, витамины, кислоты, лизоцим, бактериоцины, антибиотикоподобные вещества и др.) (Раздел 1).

10. Штаммы всех видов микроорганизмов, предлагаемые для производства пробиотиков, должны быть не вирулентными, не токсигенными, не токсичными, безопасными для людей, включая, при необходимости, иммунологическую безопасность. Исследование осуществляют в соответствии с ОФС "Безопасность пробиотиков для медицинского применения" (Раздел 3).

11. Предполагаемые штаммы должны быть изучены на лабораторных моделях для оценки механизма их терапевтического действия при введении способом, рекомендованным для человека.

12. В готовой форме препарата оценивают соотношение терапевтической и безопасной дозы, (клинические исследования, фаза I - оценка переносимости, безопасности, терапевтического действия, подтверждение механизма действия), сохранение продукции биологически активных веществ, живых микробных клеток на протяжении срока годности экспериментально-производственных серий препарата.

14. Рекомендуемый для изготовления пробиотических препаратов штамм должен быть депонирован в Национальной коллекции или Международной коллекции с указанием источника и даты выделения, характеристики биологических свойств.

Раздел 1. Изучение морфологических, тинкториальных и культуральных свойств

1.1 Изучение морфологии и тинкториальных свойств культур

1.1.1. Микроскопия живых бактерий

Живые микробы исследуют в препаратах, приготовленных методом "раздавленной" и "висячей" капли.

Материалы:

Исследуемые штаммы; жидкие или плотные селективные питательные среды; предметные (или предметное стекло с вышлифованным углублением-лункой) и покровные стекла; фильтровальная бумага; пинцет; микроскоп.

Приготовление препарата "раздавленной" капли используют для выявления активной подвижности микробов.

На предметное стекло наносят каплю 16 - 24-часовой бульонной культуры. При обильном росте микробов культуру предварительно разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида, т.к. наличие большого количества микробных тел в поле зрения затрудняет наблюдение за отдельными бактериями и их подвижностью. Нанесенную на предметное стекло каплю "раздавливают", накладывая на нее покровное стекло. При "раздавливании" капли нужно избегать образования в ней пузырьков воздуха. Для этого покровное стекло накладывают не сверху, а ставят на ребро у края капли и опускают постепенно, вытесняя воздух, находящийся между предметным и покровным стеклами. Если часть жидкости выходит за края покровного стекла, ее отсасывают фильтровальной бумагой, зажатой браншами пинцета, и затем бумагу с культурой помещают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Препарат "раздавленной" капли, предназначенной для выявления подвижности микробов, рассматривают под микроскопом с увеличением (объектив х40 или х50, окуляр х10 или х15, при опущенном конденсоре).

При приготовлении "висячей" капли на середину обезжиренного покровного стекла наносят небольшую с четкими краями каплю бульонной культуры. После этого покровное стекло переворачивают каплей вниз и осторожно накладывают на предметное стекло с вышлифованным углублением-лункой так, чтобы капля не касалась дна.

"Висячую" каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. При малом увеличении (х8) находят край капли, отчетливо видимый в затемненном поле зрения. Найденный край капли устанавливают в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении и, не сдвигая препарата, переходят на более сильное увеличение (х40) или иммерсионную систему, слегка расширив диафрагму микроскопа.

Подвижные бактерии проходят с одинаковой скоростью большие пространства, иногда через все поле зрения микроскопа, вращаясь вокруг своей оси. Неподвижные бактерии постоянно колеблются между двух близлежащих точек. Колебания эти обусловлены броуновским движением.

1.1.2. Исследования бактерий в окрашенном виде

Готовят мазок из микробных культур на обезжиренном предметном стекле, высушивают и фиксируют мазок над пламенем горелки или химическим способом. Под микроскопом изучают мазки, окрашенные по Граму, - для выявления грамотрицательных и грамположительных бактерий; по методу Циля-Нильсена - для окрашивания кислотоустойчивых бактерий и выявления спор; по способу Бурри или Гинса - для выявления наличия капсул; по способу Ожешко или Пешкова - для выявления спор; по способу Нейссера - для выявления зерен валютина; по способу Романовского-Гимзе - для изучения структуры протоплазмы и ядра клеток (при необходимости).

Наличие у исследуемых микроорганизмов капсул также выявляют негативным контрастированием, применяя жидкую черную тушь или 10% водный раствор нигрозина. Эти красители не проникают в капсулу и поэтому она хорошо видна на общем темном фоне препарата. Каплю исследуемой суспензии микроорганизмов помещают в каплю разбавленного раствора фуксина, смешивают с каплей туши, закрывают покровным стеклом и просматривают с объективом (х40).

Наличие спор можно обнаружить при изучении живых клеток: споры характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому в светлом поле они видны как более темные включения округлой или овальной формы. При обнаружении спор подготовленный препарат следует изучить с помощью фазово-контрастного устройства.

В отличие от вегетативных форм клеток споры обладают высокой термоустойчивостью и после пастеризации (температура прогрева выше 80°С) остаются жизнеспособными.

Для идентификации культур следует описать вид спорообразования, расположение спор в клетке и их размеры.

Методы окрасок культур изложены в Приложение 1.

Предлагаемые штаммы не должны иметь капсулы.

1.2. Изучение культуральных свойств штамма

Культуральные свойства характерны для каждого вида бактерий, поэтому являются важным дифференцирующим признаком. Культуральные признаки бактерий определяют характером их роста на плотных, жидких и полужидких селективных и производственных питательных средах. Посев культуры на плотные питательные среды осуществляют методом Дригальского, чтобы получить изолированные колонии.

В паспорте на штамм следует описать размер, форму колоний, характер контура края, рельеф и поверхность колонии, цвет, структуру и консистенцию колонии. Подробно описать характер роста культуры на жидких и полужидких средах. Рост культуры следует изучить при минимальной, оптимальной и максимальной температуре роста, при выращивании в аэробных, анаэробных или условно анаэробных условиях.

При правильном отборе и селекции штамма не должно быть признаков диссоциации культуры (клеток и колоний) и не допускается присутствие в исследуемых культурах клеток и колоний, отличающихся по морфологическим свойствам от клеток и колоний предлагаемого штамма.

1.3. Изучение физиолого-биохимических свойств штамма

1.3.1. Тест на сахаролитические ферменты

Предназначен для дифференциальной диагностики микроорганизмов. Сахаролитическую активность предлагаемого штамма изучают с помощью зарегистрированных диагностических тест-систем для идентификации бактерий.

Предлагаемый производственный штамм должен полностью соответствовать по этим свойствам типовым штаммам видовой принадлежности согласно современной классификации "Определителя бактерий Берджи". Штаммы с неясной характеристикой не могут быть рекомендованы в качестве производственных.

1.3.2. Протеолитические свойства бактерий

В процессе культивирования микроорганизмы выделяют во внешнюю среду различные протеолитические ферменты, которые можно разделить условно на две группы: В первую группу следует включить ферменты, относящиеся к факторам патогенности (например: гиалуронидаза, фибринолизин, плазмокоагулаза, гемолизин, лицитиназа C, лизоцим, нейрамидаза).

Во вторую группу следует отнести ферменты, принимающие участие в обмене веществ микроорганизмов (дыхании, питании). Они расщепляют углеводы, белки, пептиды, аминокислоты, в результате чего образуются легкоусвояемые микроорганизмами продукты питания и продукты метаболизма - кислоты, перекиси, индол, сероводород и др.

Для оценки протеолитических свойств первой и второй групп чаще всего используются нижеприведенные методы.

2.1. Ферменты, относящиеся к факторам патогенности

2.1.1. Тест на каталазную активность

Каталазная активность свойственна большинству патогенных аэробных микроорганизмов. Облигатные анаэробы и многие микроаэрофилы каталазу не образуют.

Известно, что отсутствие способности образовывать каталазу является характерным признаком молочнокислых бактерий. Однако у некоторых молочнокислых бактерий ряд авторов обнаружили каталазную активность при использовании определенных субстратов благодаря наличию у них каталазной активности, осуществляемой так называемой псевдокаталазой и собственно каталазой. Псевдокаталаза обнаружена у штаммов Pediococus pentosaceus, Leuconostas mesenteroides, Lactobacillus plantarum при выращивании их на питательном агаре с 0,05%, но не с 1% глюкозы. Собственно каталаза проявляет свою активность на средах с гретой кровью или гематином, тогда как псевдокаталаза - на средах с низкой концентрацией глюкозы (до 0,05%). Эти ферменты не образуются при выращивании микроорганизмов на агаре с 1% глюкозы без добавления гематина или гретой крови. На активность каталазы не влияет присутствия в среде 2% глюкозы, а также изменение рН среды от 7,0 до 4,5. Поэтому продуцирование псевдокаталазы и каталазы осуществляют на следующих средах: основная среда*, гематиновый агар**, основная среда с 0,05% глюкозы, основная среда с 1% глюкозы.

Каталаза разлагает перекись водорода с образованием кислорода:

Для выявления каталазной активности наносят каплю 10% раствора пероксида на колонию или суспензию клеток. Выделение , хорошо заметное по образованию пузырьков газа, свидетельствует о продукции штаммами каталазы.

Положительный контроль - тест-штамм: S.aureus 6538-P ATCC;

Отрицательный контроль - тест-штамм: Enterococcus faecalis 2442 CCM/

Примечание:

Состав основной среды*: мясной экстракт - 0,5 г; пептон - 0,5 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г, Твин 80 - 0,05 мл; - 0,01 г; глюкоза - 1%; агар -1,5 г; вода очищенная - до 100 мл; рН среды 6,8 - 7,0. Стерилизацию проводят при 121° в течение 15 мин. К 95 мл расплавленной основной среды добавляют 5 мл смеси (1:1) дефибринированной бычьей крови и воды, после чего её прогревают при 100° в течение 15 мин для разрушения каталазы крови.

Состав гематинового агара**. Пропись среды аналогична прописи основной среды. Вместо крови добавляют гематин в количестве 50 мкг/мл из основного раствора. Его готовят внесением 50 мг гематина в 10 мл воды, после чего добавляют столько 0,1 N NaOH, сколько требуется для растворения гематина. После этого раствор прогревают при 100° в течение 15 мин.

Первые две среды разливают в чашки Петри, две другие используют в виде агаровых косяков. Посев испытуемых кисломолочных культур и тест-культуры (каталазо-положительной) осуществляют так, чтобы получить рост колоний. На выросшие колонии наносят каплю пероксида, наличие каталазы определяют по выделению пузырьков газа.

Для выявления псевдокаталазы используют среду Фелтона (Felton et al.1958).

Состав среды Фелтона (в%): триптон - 1,0; глюкоза - 0,05; - NaCL - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,5; агар - 1,5; вода очищенная до объема 100, рН 6,8 - 7,0. Среду стерилизуют, разливают в чашки Петри. На этой среде исследуется способность бактерий разлагать пероксид в присутствии незначительных концентраций глюкозы.

Предлагаемый штамм должен быть каталазоотрицательным.

2.1.2.Тест на продукцию лецитиназы

В пробирку с бульоном вносят 1 петлю суточной культуры с плотной питательной среды и инкубируют при °С в течение 24 ч. По истечении срока инкубации регистрируют наличие беловатой мути и всплывающих хлопьев, свидетельствующих о продукции микроорганизмом лецитиназы.

Материалы: питательная среда*, свежее яйцо, суточная культура исследуемого штамма, контрольные тест-штаммы: положительный контроль - S.aureus 6538-P ATCC; S.aureus "Жаев", S.aureus "Виотко"; отрицательный контроль - S.epidermidis 14990 ATCC.

Готовят бульон с яичным желтком: один яичный желток асептически вносят в 400 мл стерильного МПБ, хорошо размешивают, разливают в стерильные пробирки по 4 - 5 мл и выдерживают в термостате при °С в течение 24 ч для проверки на стерильность (среда в пробирках не должна мутнеть).

Среда для определения летициназы*

Среда предназначена для выявления фермента у стафилококков, иерсиний, анаэробов.

Состав:

Казеин панкреатического расщепления	40,0 г
	5,0 г
	1,0 г
NaCl	2,0 г
	0,1 г
Глюкоза	2,0 г
Агар-агар	25,0 г.

Ингредиенты смешивают, растворяют при нагревании в 1000 мл воды. Устанавливают pH 7,6, стерилизуют при 121°С 15 мин. Основа среды бледно-желтого цвета. К охлажденной до 50 - 55 °С основе добавляют желтки куриного яйца (1 желток на 500 мл среды). Перед использованием яйца тщательно моют в теплой воде, выдерживают 1 ч в 96%-ном этиловом спирте. Готовую среду разливают в чашки Петри.

Предлагаемый штамм не должен продуцировать летициназу.

2.1.3. Определение плазмокоагулазной активности

Материалы: сухая цитратная кроличья сыворотка или плазма крови, взятая из сердца; культура исследуемого штамма;

контрольные тест-штаммы:

положительный контроль - S.aureus 6538-P ATCC;

отрицательный контроль - S.epidermidis 14990 ATCC.

Перед исследованием сухую плазму разводят 1:5 стерильным 0,9% раствором хлорида натрия, затем 0,5 мл разведенной плазмы вносят в стерильную пробирку и в ней суспендируют одну петлю 18 - 20-часовой агаровой культуры. Пробирки помещают в термостат при °С и через 1, 2, 3, 18 и 24 ч проверяют наличие свертывания плазмы. Реакция считается положительной независимо от степени свертывания плазмы. В качестве контроля ставят реакцию со стафилококком, обладающим и не обладающим плазмокоагулазой

Предлагаемый штамм не должен продуцировать плазмокоагулазу.

2.1.4. Определение фибринолитических свойств

Материалы: культура исследуемого штамма; 0,25% раствора ;

контрольные тест-штаммы:

положительный контроль - S.pyogenes "Гуров";

отрицательный контроль - S.epidermidis 14990 ATCC; S.saprophyticus 15305.

В стерильные пробирки вносят 0,1 мл цитратной плазмы, по 0,4 мл 0,9%-ного хлорида натрия, 0,25 мл 18 - 20-часовой бульонной культуры испытуемого штамма, 0,25 мл 0,25% раствора . Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре °С на 15 - 20 мин. Если в пробирке образуется сгусток (так же как в контрольной, куда вместо бульонной культуры добавляют питательную среду), то испытуемая культура не обладает фибринолитическими свойствами. Если отмечается разжижение сгустка через 2 ч - культура характеризуется наличием фибринолизина. При дополнительном выдерживании реакции при °С и обнаружении растворения сгустка можно заключить, что культура обладает фибринолитической активностью.

Предлагаемый штамм не должен продуцировать фибринолизин.

2.1.5. Тест на лизоцим (мурамидазу)

Лизоцимную активность штамма определяют микробиологическим методом, основанным на способности лизоцима расщеплять b-(1-4)-гликозидные связи мукополисахаридного комплекса клеточной стенки эталонного тест-штамма Micrococcus luteus (Micrococcus lysodeikticus).

Готовят плотную среду, содержащую убитую культуру Micrococcus luteus UBCR 2665. Для этого предварительно культуру Micrococcus luteus выращивают на чашках Петри, содержащих МПА, в течение 16 ч при температуре °С. Выросшую культуру смывают 0,9% раствором натрия хлорида (3 мл на чашку), автоклавируют 15 мин. при 120°С и сохраняют впрок при 4°С (срок хранения суспензии - не более 1 года). В стерильные чашки вносят расплавленную плотную питательную среду, содержащую автоклавированную суспензию микрококка в концентрации 2 млрд. в 1 мл по ОСО 42-28-59-85-П мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Испытуемые штаммы выращивают в жидкой (или плотной) питательной среде, используемой для их культивирования. Культуру 2-го пассажа засевают по одной посевной петле (диаметром 2 - 3 мм) бляшками на подготовленную подсушенную плотную среду, содержащую убитую культуру микрококка. На одну чашку наносят не более 5 штаммов, посевы инкубируют в течение 2 - 4 суток при температуре °С в аэробных, анаэробных или микроаэрофильных условиях в зависимости от вида испытуемого штамма и регистрируют зону лизиса микрококка вокруг выросших макроколоний испытуемых штаммов.

О степени лизоцимной активности судят по ширине зоны просветления: низкая - 1 - 3 мм, средняя - 4 - 7 мм, 8 мм и более - высокая.

Примечание: положительный контроль - S.aureus 6538-P ATCC; S.pyogenes Dick I.

Перед экспериментом целесообразно проверить тест-штамм Micrococcus luteus на лизируемость лизоцимом. Для этого, используя отраслевой стандарт мутности, готовят микробную взвесь с содержанием в 1 мл микр. кл. и разливают ее в 2 пробирки по 1 мл. В одну (опытную) добавляют 8 мкг лизоцима, растворенного в 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида, создавая конечную концентрацию фермента 4 мкг/мл. Во вторую (контрольную) прибавляют 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Пробирки выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Культура считается пригодной для работы, если за этот период в опытной пробирке произойдет полный лизис клеток микрококка.

Примечание: некоторые виды нормальной микрофлоры (например, L. fermentum) при отсутствии других факторов патогенности продуцируют лизоцим, что считается положительным свойством микроорганизма для воздействия на патогенную и условно-патогенную микрофлору.

2.1.6. Тест на гемолизин

Некоторые бактерии продуцируют гемолизины (вещества, разрушающие эритроциты), относящиеся к факторам патогенности. В связи с этим продукция гемолизина во многих случаях является маркером вирулентности.

На кровяном агаре* выросшие колонии окружают зоны просветления. Образование гемолизинов (и, соответственно, размеры зон гемолиза) может быть вариабельным, и для адекватного определения гемолитической активности следует просматривать чашки с посевами против источника света. Активность гемолизинов может проявляться в полном или неполном разрушении эритроцитов. Виды гемолиза подразделяют на:

2.1.6.1. альфа-гемолиз - разрушение эритроцитов может быть неполным, с сохранением клеточной стромы. Просветление среды вокруг колоний обычно незначительно, позднее среда вокруг колоний может приобретать зеленовато-коричневую окраску;

Тест-штаммы:

положительный контроль - S.aureus 6538-Р АТСС; S.aureus 0-15;

отрицательный контроль - S.epidermidis 14990 ATCC.

2.1.6.2. бета-гемолиз - полное разрушение эритроцитов с ферментативным обесцвечиванием гемоглобина. Колонии бактерий окружены прозрачными зонами гемолиза различного размера;

Тест-штаммы:

положительный контроль - S.aureus "Лепин"; S.aureus 5;

отрицательный контроль - S.epidermidis 14990 ATCC.

2.1.6.3. гамма-гемолиз - эритроциты остаются без изменения.

Гемолитические свойства микробов проявляются по-разному на средах с дефибринированной кровью человека, барана, кролика, морской свинки.

Материалы: чашки Петри, испытуемые культуры;

контрольные тест-штаммы:

положительный контроль - S.aureus "Лепин"; S.aureus 5; отрицательный контроль - S.epidermidis 14990 ATCC.

Проведение теста. В расплавленный и охлажденный до 48 - 50°С 1,5% МПА или в другую питательную среду прибавляют 5% дефибринированной крови. После розлива среды в чашки Петри тонким слоем (1,5 - 2 мм) на застывшую и подсушенную поверхность штрихом делают посев 18-часовой культуры для получения изолированных колоний. Чашки инкубируют при температуре °С в течение 24 - 48 ч, после чего проводят учет результатов.

Для предохранения гемолизинов от разрушения кислородом посев культуры штрихом можно вначале произвести на питательный агар без крови. Затем на первый слой наслоить 10 мл агара (при 48 - 50°С) с 5% крови. Вокруг погруженных в агар колоний гемолиз проявляется более четко. В некоторых случаях гемолиз лучше выявляется, если после 24 - 48-часовой инкубации чашек в термостате их помещают на 18 - 24 ч в холодильник.

При проведении реакции необходимо учитывать возможное воздействие на эритроциты образующихся в процессе жизнедеятельности ряда бактерий органических кислот (молочной, муравьиной, уксусной и др.), которые могут вызывать изменения гемоглобина, сходные с гемолизом, т.е. давать ложноположительную реакцию гемолиза. Поэтому следует представить фактические данные, подтверждающие, что данный штамм не продуцирует гемолизины (отсутствие плазмид или участка гена, кодирующих синтез гемолизина).

Предлагаемые штаммы не должны обладать гемолитической активностью.

Приложение: Кровяной агар для определения гемолиза*

К 100 мл растопленного и остуженного до 45 - 50°С 2% питательного агара pH 7,4 - 7,6, соблюдая правила асептики, добавляют 5 мл стерильной дефибринированной крови: кроличьей, лошадиной, бараньей или человеческой, не содержащей консервантов или антибактериальных препаратов.

Смесь тщательно перемешивают, остерегаясь образования пены, и разливают в стерильные чашки Петри, предварительно подогретые в термостате.

Перед розливом чашки устанавливают на ровную поверхность. Слой агара должен быть не более 3 мм, одинаковым по всей площади чашки.

2.1.7. Определение гиалуронидазы

Материалы: культура исследуемого штамма; трипановый синий, селективная питательная среда.

Исследуемый штамм выращивают в жидкой селективной для штамма среде в термостате при оптимальном для культуры температурном режиме и сроке культивирования. Культуральную жидкость сначала центрифугируют при 8-10 об/мин, затем, при необходимости, фильтруют через фильтры милипор. Определение гиалуронидазы устанавливают внутрикожной инъекцией животным смеси исследуемого фильтрата культуральной жидкости с трипановым синим. Сравнением площади распространения красителя, введенного в смеси с фильтратами, и самой краски устанавливают наличие диффузного фактора. Для исключения влияния на распространение краски местного воспаления опыты ставят не только на коже живого кролика, но и снятой (предварительно депилированной) коже. Животным - кроликам или морским свинкам - вводят 0,1 мл испытуемого фильтрата и 0,1 мл 10% раствора трипанового синего. Результаты учитывают по отношению площади распространения краски в опыте и контроле - индекс диффузии.

Предлагаемый штамм не должен продуцировать гиалуронидазу.

3. Ферменты, участвующие в обмене веществ

3.1. Тест на продукцию желатиназы

Метод 1. К питательной среде добавляют желатин (из расчета 10 - 15 г на 100 мл), разливают в пробирки столбиком. Посев испытуемой культуры осуществляют уколом, погружая петлю с культурой вглубь питательной среды. Засеянную культуру инкубируют в термостате при оптимальной для нее температуре в течение 1 - 2 сут. Вместе с опытными пробирками в термостат ставят две пробирки с незасеянной культурой для контроля. При регистрации результатов учитывают интенсивность роста и форму разжижения желатиновой среды.

Метод 2. О продукции желатиназы судят по обесцвечиванию полоски фотопленки, помещенной в пробирку с исследуемой культурой.

Полоски фотопленки размером 25 х 3 мм, освещенной и проявленной, прокладывают кусками фильтровальной бумаги, помещают в чашку Петри и автоклавируют при 110°С (0,5 атм.) в течение 30 мин.

Исследуемую культуру бактерий засевают в пробирки с МПБ, под пробку пробирки вставляют полоску стерильной фотопленки так, чтобы верхняя часть ее оставалась не погруженной в среду. Посевы инкубируют в термостате при °С. Если культура разжижает желатину, погруженная часть пленки становится прозрачной, а черная пыль редуцированного серебра выпадает на дно пробирки. Большинство бактерий, продуцирующих желатиназу, обесцвечивают полоску в течение суток. При отрицательных результатах посевы оставляют в термостате до 7 суток.

Предлагаемый штамм не должен разжижать желатину.

Тест-штаммы:

положительный контроль - P.mirabilis 3177; P.vulgaris 24 a; M.morganii 417;

отрицательный контроль - Yersenia enterocolitica N 134;

желатин, фотопленка.

Питательный желатин (для определения желатиназы)

Бульон Хоттингера 1000 мл

Желатин пищевой высшего сорта 100,0 г.

Желатин вносят в бульон для набухания на 1,5 - 2 ч, нагревают на водяной бане при 40 - 50°С до полного расплавления. Устанавливают pH 7,2. При необходимости среду фильтруют или осветляют с помощью суспензии куриных яиц (2 яйца, размешанных в двойном объеме холодной воды, вносят в среду, нагревают до свертывания белка, затем снова фильтруют). Разливают в пробирки по 8 - 9 мл. Стерилизуют при 112°С 30 мин. Готовая среда имеет желтовато-коричневый цвет.

3.2. Тест на продукцию протеазы

У некоторых видов патогенных бактерий продукция протеазы является одним из факторов патогенности.

О продукции протеазы судят по образованию прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре, содержащем казеин.

Приготовление агара с казеином. Готовят 2% раствор казеина на 0,1 М трис-HCl буфере (pH 7 - 8). Раствор подогревают до °С и смешивают в равных объемах с раствором 2% агара Дифко, охлажденного до той же температуры. Полученный казеиновый агар разливают в условиях стерильности по 10 мл в стерильные чашки Петри.

После застывания агара высевают испытуемую культуру штрихом и инкубируют в термостате при °С в течение 18 ч. По окончании инкубации в чашки наливают 5 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и наблюдают в течение 3 мин. за появлением прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре.

Примечание:

тест-штаммы:

положительный контроль - V.Cholera non 01 N P-9741;

3.3. Тест на продукцию амилазы

О продукции амилазы судят по образованию прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в картофельном агаре.

Материалы: испытуемый штамм; тест-штаммы: положительный контроль - отрицательный контроль - P.mirabilis 3177; P.vulgaris 24 a; P.vulgaris 222; картофельный агар.

Приготовление картофельного агара. Очищенный от кожуры сырой картофель промывают, нарезают ломтиками, заливают водой из расчета 130 г на 1 л воды, кипятят 30 мин., фильтруют и к фильтрату добавляют 20 г агара и 2 г NaCl. Нагревают, помешивая стеклянной палочкой до полного расплавления агара, если необходимо снова фильтруют, разливают в пробирки по 5 мл, укупоривают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве 30 мин. при 110°С (0,5 атм.) в течение 30 мин.

Готовый картофельный агар разливают по 10 мл в стерильные чашки Петри. После застывания агара культуру засевают штрихом, инкубируют в термостате при °С в течение 24 ч. Культуру в чашках заливают 5 мл раствора Люголя. Наблюдают в течение 5 мин. за появлением светлых зон вокруг посевов.

3.4. Тест на продукцию липазы

О продукции липазы судят по образованию прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре, содержащем ТВИН-20.

Готовят 2%-ный агар на 0,06 М фосфатном буфере (pH 7,4 - 7,6). ТВИН-20 нагревают на водяной бане до °С и вносят в расплавленный агар до конечной концентрации 1%. Быстро перемешивают встряхиванием и добавляют 10%-ный раствор до конечной концентрации 0,1%. Тщательно перемешивают, разливают в пробирки по 10 мл, укупоривают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют на водяной бане в течение 40 мин. Разливают по 10 мл в стерильные чашки Петри.

Культуру, выращенную на МПБ при °С в течение 18 - 24 ч, высевают штрихом на агаровую среду с ТВИН-20 и инкубируют при °С в течение 24 ч. По истечении срока инкубации регистрируют появление или отсутствие прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре.

3.5. Тест на продукцию аргениндегидрогеназы

Материалы: испытуемый штамм; тест-штаммы: положительный контроль - S.aureus 6538-P ATCC; отрицательный контроль - Yersenia enterocolitica N 134; среда Шеррис.

Продукцию аргениндегидрогеназы изучают на среде Шеррис. Пробирку со средой Шеррис и контрольную (без аргинина) засевают 18-часовой культурой и заливают стерильным вазелиновым маслом. Посевы инкубируют при °С в течение 5 дней. О разложении аргинина свидетельствует появление фиолетовой окраски в опытной пробирке.

Для оценки этих свойств чаще всего используют желатин, молоко.

3.6. Тест на редукцию нитратов

Материалы: испытуемый штамм; среда Кларка; тест-штаммы: положительный контроль - ; отрицательный контроль - Yersenia enterocolitica N 134; P.mirabilis 3177; P.vulgaris 24 a, M.morganii 417.

Редукцию нитратов определяют после роста культуры на бульоне с нитратами в течение 24 - 72 ч. В каждую пробирку с засеянным нитратным бульоном прибавляют по 1 мл реактива (раствор N 1: 1 г растворимого крахмала, 0,5 г KJ, 100 мл дистиллированной воды; раствор N 2: 10%-ный раствор химически чистой . Перед постановкой реакции равные части растворов смешивают. Реактив используется в течение 15 мин.). Если нитрат восстановлен в нитрит, то наблюдается темно-синее окрашивание. Для этих целей можно использовать реактив Грисса. В присутствии нитратов отмечается розовое окрашивание.

Реакция Фогес-Проскауэра

Реакция Фогес-Проскауэра определяет наличие в среде ацетона. Для постановки реакции Фогес-Проскауэра культуру выращивают на среде Кларка 1 - 3 суток при температуре °С. Затем 1 мл культуральной жидкости переносят в пробирку и добавляют 0,6 мл альфа-нафтола (5%-ный раствор в абсолютном спирте) и 0,2 мл 40%-ного раствора KOH и взбалтывают. При положительной реакции через 2 - 5 мин. наблюдается розовое окрашивание. В случае отрицательной реакции розового окрашивания не наблюдается и раствор принимает цвет меди.

Примечание: Среда Кларка для реакции с метиловым красным (MR) и Фогеса-Проскауэра (VP)

Состав:

Пептон	0,5 г
Гидроортофосфат калия	0,5 г
Глюкоза	0,5 г
Дистиллированная вода	80 мл.

Перечисленные ингредиенты размешивают при подогревании в течение 20 мин. Фильтруют через бумажный фильтр, охлаждают до 20°С и доводят объем до 100 мл дистиллированной водой. Разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют 3 дня в текучепаровом аппарате по 30 мин.

А. Реактив к реакции с метиловым красным

Метиловый красный	0,1 г
Спирт этиловый	300 мл
Вода дистиллированная	200 мл

Краску растворяют в спирте, затем прибавляют воду. Для испытания реагент добавляют в количестве 5 - 6 капель.

Б. Реактив к реакции Фогеса-Проскауэра

Реактив 1. Навеска альфа-нафтола 5 г растворяется в 100 мл 96% этилового спирта.

Реактив 2. Навеска KOH 40 г растворяется в 100 мл дистиллированной воды.

3.7.Тест на гидролиз мочевины

О способности к гидролизу мочевины судят по покраснению среды, содержащей мочевину.

Материалы: испытуемый штамм; тест-штаммы: положительный контроль - Yersenia enterocolitica N 134; P.mirabilis 3177; P.vulgaris 24 a, P.vulgaris 222; M.morganii 417; отрицательный контроль - Listeria monocytogenes 766.

Готовят бульон с мочевиной: к 100 мл стерильного МПБ (pH 7,0) добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл крезолового красного (1,6%-ный спиртовой раствор). Разливают по 2 - 3 мл в стерильные пробирки, укупоривают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют текучим паром в течение 10 мин.

В пробирку с бульоном, содержащим мочевину, вносят 1 петлю суточной культуры с МПА, инкубируют в термостате при °С в течение 20 - 24 ч. Покраснение среды свидетельствует о наличии фермента уреазы и способности культуры гидролизовать мочевину.

3.8. Тест на расщепление тирозина

О разложении тирозина судят по исчезновению кристаллов тирозина вокруг посевов в агаре.

Материалы. Испытуемый штаммы; тест-штаммы: положительный контроль - P.mirabilis 3177; отрицательный контроль - Yersenia enterocolitica N 134; P.vulgaris 24 a, P.vulgaris 222; M.morganii 417.

Готовят агар с тирозином: 0,5 г L-тирозина суспендируют в 10 мл дистиллированной воды, помещают в пробирку, укупоривают ватно-марлевой пробкой и автоклавируют при 110 °С (1,5 атм.) в течение 30 мин. Охлажденный до °С раствор тирозина в стерильных условиях смешивают с 100 мл расплавленного стерильного МПА и разливают по 10 мл в стерильные чашки Петри.

После застывания агара культуру высевают на чашки штрихом и инкубируют в термостате при °С в течение 24 ч. Наблюдают за исчезновением кристаллов тирозина вокруг посевов в агаре.

3.9. Тест на утилизацию цитрата

Об утилизации цитрата судят по наличию роста культуры на среде Козера.

Готовят среду Козера:

NaCl - 5 г, - 0,2 г, - 1 г, K2 - 1 г, агар - 20 г, Na лимонно-кислого - 2 г, дистиллированной воды до 1 л. Среду помещают в бутыль вместимостью 3 л, укупоривают ватно-марлевой пробкой, оборачивают пергаментом и стерилизуют при 110°С (0,5 атм.) 30 мин. Разливают по 10 мл в стерильные чашки Петри.

После застывания агара культуру высевают на чашки с агаризованной средой Козера штрихом и инкубируют в термостате при °С в течение 24 ч. По окончании срока инкубации регистрируют наличие роста культуры.

Примечание: положительный контроль - P.mirabilis 3177; отрицательный контроль - Yersinia enterocolitica N 134; P.vulgaris 24 a, P.vulgaris 222; M.morganii 417.

3.10. Тест на образование аммиака, индола, сероводорода

Об образовании газов судят по изменению цвета индикаторной бумаги, помещенной под пробку пробирки с исследуемой культурой.

Готовят индикаторную бумагу. Фильтровальную бумагу нарезают на полоски размером 3 х 10 мм и пропитывают индикаторными растворами.

А. Индикаторная бумага на аммиак по методу Крупа: смешивают 2 мл 1%-ного водного раствора фуксина, приготовленного из насыщенного спиртового раствора, с 1 мл 3%-ной серной кислоты. После того как раствор приобретет бурую окраску, им пропитывают фильтровальную бумагу и высушивают. Бумага должна быть бесцветной или слегка желтой. Хранят бумагу в банке с притертой пробкой.

Б. Индикаторная бумага на сероводород: полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором уксуснокислого свинца (в 100 мл дистиллированной воды 20 г уксуснокислого свинца и 1 г двууглекислой соды) и высушивают.

В. Индикаторная бумага на индол по Морелю: полоски фильтровальной бумаги пропитывают насыщенным водным раствором щавелевой кислоты и высушивают.

Готовят пробирки с мясо-пептонным бульоном, приготовленным на переваре Хоттингера, содержащем большое количество свободного триптофана.

В пробирки с МПБ вносят по 1 петле суточной исследуемой культуры, выросшей на чашках с МПА.

Тотчас же после посева приготовленные полоски индикаторной бумаги помещают в пробирку так, чтобы они не касались питательной среды.

Посевы инкубируют в термостате при температуре °С в течение 24 - 48 ч. При образовании аммиака индикаторная бумага краснеет, сероводорода - чернеет, при выделении индола бумага приобретает сиреневый или малиновый цвет.

Примечание:

3.11. Сквашивающая способность штамма

Односуточную культуру исследуемого штамма засевают в стерильное молоко из расчета 3 - 5% посевного материала к объему молока. Пробирки с посевным материалом и со стерильным молоком без культуры (контроль) помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре в течение 2 - 3 суток. При регистрации результатов учитывают способность культуры сквашивать молоко, образовывать сгусток и определяют кислотность титрометрическим способом.

Данный метод рекомендован в качестве ориентировочного теста. Ряд штаммов кисло-молочных культур могут не сквашивать молоко с образованием сгустков, но продуцируют вещества, изменяющие кислотность питательной среды. Поэтому следует определять активность кислотообразования, показатель которой выражается в градусах Тернера (°Т), по методу, описанному в ОФС "Специфическая активность пробиотиков для медицинского применения".

4.1. Исследования на совместимость штаммов

Совместимость штаммов в комплексном препарате определяют по антагонистическому действию штаммов друг на друга при совместном их культивировании.

1 Метод. Моноштаммы, каждый в отдельности, засевают в адекватную для их роста полужидкую питательную среду, при росте в которой формируются четко дифференцируемые по морфологии колонии. По окончании времени культивирования определяют количественное содержание каждого штамма в 1 мл. Затем осуществляют совместное культивирование 2 - 3 штаммов на полужидкой среде и по истечении времени культивирования оценивают: а) возможность дифференциации испытуемых штаммов по морфологическим признакам; б) количественное содержание каждой выросшей культуры в 1 мл.

2 Метод. Моноштамм засевают в полужидкую питательную среду. По окончании времени культивирования культуральную среду освобождают от бактериальных клеток сначала путем центрифугирования в условиях щадящего режима, а затем фильтрации надосадочной жидкости через миллипоры для полного освобождения от бактериальных клеток. Центрифугат культуральной среды используют в нативном виде или в соответствующем разведении для посева в него штаммов (последовательно) комплексного препарата с целью определения влияния продуктов метаболизма на рост испытуемой культуры.

Примечание: для стандартизации условий испытания необходимо:

1) определять мутность взвеси испытуемой культуры по стандарту ОСО 42-28-59-85-П мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича;

2) подтверждать количество жизнеспособных клеток в 1 мл при раздельном культивировании каждого штамма на питательной среде - контроль.

4.2. Штаммы-антагонисты определяются методом отсроченного антагонизма в соответствие с ОФС "Специфическая активность пробиотиков для медицинского применения". Штаммы не должны угнетать рост друг друга.

5. Определение чувствительности пробиотических штаммов к антибиотикам

5.1. Чувствительность к антибиотикам определяют методами серийного разведения антибиотика в жидкой питательной среде и/или диффузионным в соответствии с утвержденными нормативными документами (МУК 4.2.1890-04). Определяют минимальную подавляющую концентрацию (МПК) для характеристики чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам. За минимальную подавляющую концентрацию (МПК) принимают концентрацию, подавляющую видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной среде. Эта концентрация определяет степень чувствительности штамма к антибиотику.

Исследованию по оценке антибиотикочувствительности подлежат чистые культуры микроорганизмов, принадлежность которых к определенному виду подтверждена фено- и генотипическими методами исследования.

Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность антибактериальных препаратов (АБП) - величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК).

Для определения МПК заданные концентрации АБП вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма, и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

5.2. Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит МПК.

Из существующих в настоящее время диффузионных методов наиболее приемлемым для оценки антибиотикочувствительности является Е-тест.

Е-тест представляет собой узкую полоску полимера (0,5 х 6,0 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация АБП, диффундирующего из носителя, выше МПК, при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю. Детальные инструкции по определению чувствительности с использованием Е-тестов прилагаются изготовителем к набору реактивов.

6. Определение устойчивости штамма к действию желудочного сока и желчи

Производственные штаммы должны быть устойчивы к действию желудочного сока, желчи, повышенному содержанию соли и щелочи при прохождении через желудочно-кишечный тракт для сохранения жизнеспособности культур, вошедших в состав пробиотиков. Если эти свойства у рекомендуемого штамма не обнаружены или снижены, а культура характеризуется продукцией уникальных биологически активных веществ, обладающих терапевтическим действием, следует провести исследования для подбора вспомогательных веществ или лекарственной формы (напр., кислотоустойчивые капсулы, таблетки с защитным покрытием и др.), обеспечивающих максимальное сохранение жизнеспособности пробиотических культур.

1.1. Способ 1

В пробирку, содержащую 9 мл желчи медицинской консервированной, засевают 1 мл испытуемой культуры с концентрацией оптических единиц мутности. Культуры инкубируют в термостате при температуре 37 - 38 °С в течение 24 - 72 ч, в зависимости от вида микроорганизма. Рост или отсутствие роста культуры отмечают визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности, а также контролируют выборочно по микроскопическому препарату.

1.2. Способ 2

Исследуемый штамм засевают на целлофане, положенном на адекватную агаризованную среду, с последующим инкубированием при температуре 37°С в течение 16 - 18 ч. После чего выросшую культуру смывают забуференным фосфатным натрия хлорида раствором 0,9% (ЗФР) и доводят концентрацию до КОЕ/мл. В пробирку с 1 мл бактериальной взвеси добавляют 9 мл биологической жидкости (желчь медицинская консервированная, желудочный сок "Эквин"); контроль - 9 мл ЗФР. Все пробирки выдерживают в термостате при °С в течение двух часов, затем определяют количество жизнеспособных клеток методом серийных разведений с последующим высевом на адекватную среду.

7. Тест на устойчивость штамма к щелочной реакции среды

В питательную среду с pH от 8,0 до 9,6, используемую для культивирования исследуемого штамма, засевают культуру (1 петля на 8 - 10 мл среды).

Посевы выдерживают в термостате при оптимальной для штамма температуре в течение 24 - 48 ч. Рост или отсутствие роста культуры отмечают визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности.

8. Тест на устойчивость штамма к повышенным концентрациям соли

В питательную среду, используемую для культивирования исследуемого штамма, содержащую 2,4% и 6,5% NaCl (pH 6,8 - 7,0), засевают культуру (1 петля на 10 мл среды) и выдерживают в термостате при оптимальной для штамма температуре в течение 48 ч.

Рост или отсутствие роста культуры отмечают визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности, а также контролируют выборочно по микроскопическому препарату.

9. Определение продукции штаммом бактериоцинов и чувствительности бактерий к его действию

На чашках с 1,5% питательным агаром Difco размечают точки, соответствующие количеству штаммов, и помещают 2 - 5 мкл 12-часовой культуры испытуемых штаммов. Количество чашек должно соответствовать количеству тест-культур с учётом контрольных чашек. Чашки инкубируют при °С в течение 4 - 12 ч. Инициируют продукцию колицина ультрафиолетовым облучением в течение 30 с, затем инкубируют в тех же условиях еще 3 - 12 ч. После культивирования в течение 48 ч проводят инактивацию культур хлороформом следующим образом: чашку Петри переворачивают вверх дном, снимают крышку и кладут во внутрь фильтровальную бумагу, смоченную 300 мкл . Экспозиция выдерживается около 30 мин., затем заменяют крышки на стерильные, инактивированные посевы проветривают около 15 мин. После этого наслаивают на нижний слой агара 3 - 5 мл верхнего 0,7% агара, содержащего КОЕ/мл тест-штамма. Инкубируют в течение 12 - 16 ч при °С. Регистрируют наличие зон просветления в слое тест-культуры вокруг пятен исследуемых штаммов. Таким способом можно одновременно оценить способность исследуемого штамма продуцировать колицин, а также чувствительность штамма к колицину.

10. Исследование продукции лизоцима (мурамидазы) штаммом

Некоторые виды нормальной микрофлоры (например, L. fermentum) при отсутствии других факторов патогенности продуцируют лизоцим, что считается положительным свойством микроорганизма для воздействия на патогенную и условно-патогенную микрофлору.

Материалы: питательная среда МПА; культура Micrococcus luteus UBCR 2665; испытуемые штаммы; лизоцим сухой; ОСО 42-28-59-85-П мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича; чашки Петри; 0,9% раствор натрия хлорида

Перед экспериментом целесообразно проверить тест-штамм Micrococcus luteus на лизируемость лизоцимом. Для этого, используя отраслевой стандарт мутности, готовят микробную взвесь с содержанием в 1 мл 109 микр. кл. и разливают ее в 2 пробирки по 1 мл. В одну (опытную) добавляют 8 мкг лизоцима, растворенного в 1 мл физиологического раствора, создавая конечную концентрацию фермента 4 мкг/мл. Во вторую (контрольную) прибавляют 1 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Пробирки выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Культура считается пригодной для работы, если за этот период в опытной пробирке произойдет полный лизис клеток микрококка.

11. Определение наличия фагов у производственных штаммов, используемых для изготовления пробиотиков для медицинского применения

Определение наличия фагов в предлагаемом штамме проводят путем высева взвеси культуры 2-го, 3-го пассажа на соответствующую плотную питательную среду в объеме не более 1 мл (с концентрацией от 107 - 109 в мл). Перед посевом чашки Петри с питательной средой подсушивают в термостате для удаления конденсата. Микробную взвесь равномерно распределяют по поверхности среды путем покачивания чашек, чтобы получить сплошной газон. Остатки взвеси отсасывают стерильной пастеровской пипеткой. Затем чашки помещают в термостат при температуре °С. Через 19 - 36 ч учитывают результат посева. На сплошном росте посеянной культуры не должно быть зон фаголизиса.

Раздел 2. Требования к тест-штаммам, используемым, для определения антагонистической активности производственных штаммов, посевных культур и готовых лекарственных форм пробиотиков.

Пробиотические штаммы должны проявлять антагонистическую активность по отношению к тест-штаммам патогенных и условно патогенных микроорганизмов, не должен угнетать рост представителей нормофлоры. Перечень тест-штаммов для контроля антагонистической активности определяют на основании результатов клинических (лечебное действие) и микробиологических (влияния на определенную группу патогенных и условно патогенных микроорганизмов) испытаний эффективности и безопасности конкретных групп препаратов. Рекомендуемые тест-штаммы должны быть идентифицированы до вида по фено- и генотипическим признакам, должны быть однородны по морфологическим, тинкториальным, культуральным, физиолого-биохимическим свойствам, и охарактеризованы по вирулентным, патогенным свойствам, токсичности.

Тест-штаммы должны быть депонированы в национальной или международной коллекции с указанием источника и даты выделения, характеристики биологических свойств.

Тест-штаммы должны соответствовать требованиям

Подлинность. Подлинность каждого тест-штамма определяется микробиологическими методами. Культуры должны обладать однородными морфологическими, тинкториальным, культуральными и физиолого-биохимическими свойствами без признаков диссоциации.

Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов. Испытание выполняют с использованием селективных питательных сред для того, чтобы в выбранных условиях инкубации был обеспечен рост контаминантов. Культура не должна содержать посторонней микрофлоры. Определение проводят в соответствии с ОФС "Микробиологическая чистота", если в частной фармакопейной статье не указаны другие требования.

Количественное содержание живых микроорганизмов штамма. Испытание проводят по методу в соответствии с ОФС "Специфическая активность пробиотиков для медицинского применения". Содержание живых микроорганизмов выражают в определенном объеме (в 1 мл, в ампуле/флаконе), если в частной фармакопейной статье не указаны другие требования.

Вирулентность, токсигенность, токсичность, безвредность.

Штаммы должны быть охарактеризованы по вирулентности, токсигенности, токсичности, безвредности.

Испытание проводят по методам в соответствии с ОФС "Безопасность пробиотиков в тестах in vivo"

Хранение, упаковка. Тест-штаммы хранят в лиофильно высушенном состоянии при температуре, обеспечивающей сохранения первоначальных биологических свойств на протяжении срока годности в изолированных от производственных помещениях. На ампулу (флакон) высушенного штамма наносят следующие сведения: наименование и номер штамма, дата лиофилизации, порядковый номер лиофилизации, срок годности.

Тест-штаммы контролируют ежегодно по всем биологическим свойствам, указанным в нормативной документации. Результаты контроля фиксируют в специальном журнале и отражают в паспорте штамма.

Исследование по изучению антагонистической активности осуществляют в соответствии с ОФС "Определение специфической активности пробиотиков для медицинского применения", набор тест-штаммов указывается в частной фармакопейной статье.

Величина зоны угнетения роста изучаемых штаммов относительно друг к другу не должна быть более 10 мм.

Раздел 3. Исследование адгезивной активности пробиотических штаммов

Адгезивная активность - способность бактерий прикрепиться к эпителию кишечника и размножиться прежде, чем клетки слизистого слоя будут обновлены.

Для обеспечения данной функции бактерии синтезируют ряд структур (пили/фимбрии), посредством которых происходит их прикрепление к эпителиальной клетке. Эти структуры называются факторами колонизации или адгезии, у некоторых микроорганизмов относятся к факторам патогенности. Бактерии способны экспрессировать различные типы фимбрий, которые кодируются различными хромосомальными и плазмидными генами. Это генетическое разнообразие позволяет клеткам адаптироваться к изменяющейся окружающей среде и использовать эту возможность по отношению к различным поверхностным структурам хозяина.

Механизм специфической адгезии включает две фазы: обратимую и необратимую. Обратимая фаза может быть обеспечена гидровзаимодействием, электростатическим притяжением, броуновским движением, а также атомными и молекулярными вибрациями. Необратимая специфическая фаза обеспечивается множеством связей типа замок-ключ между комплементарными молекулами на каждой из клеточных поверхностей, как только эти связи сформировались, прикрепление бактерий становится необратимым.

Для исследования адгезии используют суточные культуры штаммов.

Суточную культуру штамма, выращенную на скошенной адекватной питательной среде, смывают забуференным фосфатным физиологическим раствором (ЗФР) и затем дважды отмывают ЗФР с pH 7,2 центрифугированием (1500 об./мин. - 10 мин.). Кроме того, культуры можно выращивать на плотной среде, покрытой целлофаном, при 37°С в течение 16 - 18 ч. Готовят суспензию, содержащую КОЕ/мл (культуры, выращенные на целлофане, доводят до указанной концентрации без отмывания).

1. Метод определения адгезии микробов к эритроцитам

Эритроциты дважды отмывают от консерванта в ЗФР центрифугированием (1000 об./мин. - 10 мин.) и доводят до нужной концентрации КОЕ/мл.

Подсчет концентрации эритроцитов производят в камере Горяева под световым микроскопом по общепринятой методике.

Затем в пробирку с 0,5 мл взвеси микробов вносят 0,5 мл взвеси эритроцитов, инкубируют 30 мин. при температуре °С, периодически встряхивая. Потом смесь трехкратно отмывают ЗФР от неприлипших микробов при 600 об./мин. по 10 мин.

На предметном стекле готовят мазок, фиксируют смесью Никифорова, окрашивают по Романовскому-Гимзе, при микроскопировании проводят оценку уровня адгезии.

Средний показатель адгезии (СПА) определяют по среднему числу микробов, прилипших к поверхности одного эритроцита, подсчитывая все имеющиеся эритроциты в 5 полях зрения, но не менее 50 эритроцитов.

Степень адгезивности считают нулевой при СПА от 0 до 0,99; низкой - от 1,00 до 1,99; средней - от 2,00 до 3,99 и высокой > 4,00.

Из числа учитываемых эритроцитов подсчитывают процент эритроцитов (К%), имеющих на своих поверхностях прилипшие микробы.

Кроме того, подсчитывают индекс адгезивности микроба (ИАМ) - среднее количество микробных клеток на одном эритроците, участвующем в адгезивном процессе, по формуле:

Микроорганизмы считают:

- неадгезивными при ИАМ от 1,00 до 1,75;

- низкоадгезивными - от 1,76 до 2,49;

- среднеадгезивными - от 2,50 до 3,99;

- высокоадгезивными > 4,00.

2. Метод определения адгезии микробов к эпителиальным клеткам кишечника крыс или мышей

Адгезивность штаммов изучают в системе in vitro на эпителиальных клетках тонкой и толстой кишки крыс линии Фишер или любой другой линии или б/п мышей. Крыс или мышей забивают углекислым газом, из кишечника выделяют кусочки размером 5 х 5 мм, тщательно отмывают от слизи и содержимого в ЗФР. Эпителиальные клетки получают из кусков слизистой кишечника на вибраторе модели ВПП.

Клетки дважды отмывают охлажденным ЗФР (pH 7,2) центрифугированием при 800 об./мин. по 10 мин. После определения концентрации взвеси клеток с помощью камеры Горяева под световым микроскопом ее доводят до кл./мл. Готовят суспензию испытуемой культуры концентрацией КОЕ/мл.

На 0,5 мл взвеси эпителиальных клеток наносят 0,5 мл взвеси бактериальной культуры. Клеточно-бактериальную смесь инкубируют в термостате при °С в течение 30 мин., периодически встряхивая. Затем смесь трехкратно отмывают ЗФР от неприлипших микробов при 600 об./мин. по 10 мин. Все манипуляции осуществляют на холоде. К осадку добавляют 1 - 2 капли ЗФР и готовят мазки на стекле. Препараты фиксируют 96° спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимзе.

Под световым микроскопом подсчитывают среднее количество бактерий, прилипших к 25 энтероцитам или колоноцитам.

При оценке адгезии каждого штамма микроорганизма опыт повторяют не менее 3 раз. Подсчитывают средний показатель адгезии (СПА), число микробов на 1 клетку - микроб/клетка в 10 полях зрения, учитывая результаты всех опытов.

Уровень адгезии отдельных штаммов бактерий условно дифференцирован на четыре степени:

- неадгезивную (СПА = 0);

- слабоадгезивную (СПА = 1 - 5);

- среднеадгезивную (СПА = 5 - 10);

- высокоадгезивную (СПА выше 10).

3. Определение уровня адгезивной активности штаммов пробиотиков на модели эпителиальных клеток влагалища

Забор материала для получения изолированных эпителиальных клеток производят при проведении диагностической гистероскопии и раздельном диагностическом выскабливании стенок шейки матки и цервикального канала при различных неинфекционных заболеваниях тела матки.

В асептических условиях под внутривенной анестезией шейка матки обнажается куско- или ложкообразными зеркалами. После этого производят соскоб эпителия слизистой боковых стенок влагалища.

После забора материал помещают в транспортный контейнер с жидкой питательной средой N 199. Контейнер обкладывается льдом.

Далее готовят суспензию штамма с концентрацией микробных кл./мл, 0,5 мл взвеси эпителиальных клеток смешивают с 0,5 мл взвеси бактериальной культуры.

Клеточно-бактериальную смесь инкубируют в термостате при °С в течение 30 мин., периодически встряхивая. Потом смесь трехкратно отмывают ЗФР от неприлипших микробов при 600 об./мин. по 10 мин.

Все манипуляции осуществляют на холоде. К осадку добавляют 1 - 2 капли ЗФР и готовят мазки на стекле. Препараты фиксируют смесью равных частей медицинского эфира и 96° спирта и окрашивают по Романовскому-Гимзе.

Под световым микроскопом подсчитывают среднее количество бактерий, прилипших к 25 эпителиоцитам.

При оценке адгезии каждого штамма опыт повторяют не менее 3 раз. Подсчитывают средний показатель адгезии (СПА), число микробов на 1 клетку - микроб/клетка в 10 полях зрения, учитывая результаты всех опытов.

Степень адгезивности считают:

- неадгезивную (СПА = 0);

- слабоадгезивную (СПА = 1 - 5);

- среднеадгезивную (СПА = 5 - 10);

- высокоадгезивную (СПА выше 10).

Штаммы с высокой адгезивной активностью не следует рекомендовать для производства пробиотиков.

Раздел 4. Определения безопасности пробиотических штаммов

Определение вирулентности, токсичности, токсигенности и безвредности осуществляют в соответствие с ОФС "Безопасность пробиотиков в опытах in vivo".

1. Экспериментальные животные

Животные.

Для токсикологических исследований используют здоровых животных, полученных из сертифицированных питомников. Вирулентность, токсигенность, токсичность (общую, "острую" и "хроническую"), безвредность, дермонекротические и другие свойства определяют не менее чем на двух видах (нелинейных или линейных) или двух линиях одного вида животных в зависимости от изучаемого штамма. Исследования проводят на животных обоего пола. Данные, полученные в опытах на самках и самцах, учитывают отдельно для оценки воспроизводимости результатов испытания.

Для исключения большого разброса в исследуемых показателях следует использовать животных одного возраста. Разброс по исходной массе тела не должен превышать %. Рекомендуемая масса тела животных в начале опыта: мыши - от 10 до 14 г; крысы - от 100 до 140 г; морские свинки - от 250 до 450 г; кролики - от 1,5 до 2,5 кг.

Партия животных из питомника должна сопровождаться ветеринарным свидетельством или ветеринарной справкой. Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляет не менее 3 - 4 суток. В течение карантина проводят ежедневный осмотр животных (общее состояние и поведение). В случае гибели в этот период более 10% поступивших животных испытание токсичности на данной партии исключается.

Клетки с животными помещают в отдельные комнаты. Световой режим: 12 ч - свет, 12 ч - темнота. Температуру воздуха поддерживают в пределах 19 - 25°С, относительную влажность - 30 - 70%. Содержание экспериментальных животных должно соответствовать действующим санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев).

Рекомендуется давать животным стандартную диету в соответствии с действующими нормами. Для обеспечения водой мелких лабораторных животных целесообразно использовать автопоилки. Кормление следует производить в фиксированное время, т.к. прием пищи может изменить чувствительность животных. Наряду с подопытными животными из этой же партии в аналогичных условиях содержатся контрольные животные.

Формирование групп подопытных и контрольных животных проводят методом случайной выборки (единица выборки - животное).

Материалы: испытуемые тест-штаммы; оптический стандарт мутности на 5 МЕ и 10 МЕ; селективные питательные среды; шприцы вместимостью 1 мл с ценой деления 0,05 мл, 2 мл с ценой деления 0,1 мл.

Определение дермонекротических свойств испытуемых штаммов

Для этой цели используют белокожих кроликов породы шиншилла массой тела 1,5 - 2,5 кг или морских свинок массой тела 300 - 450 г. Разные концентрации микробной взвеси в объеме 0,1 - 0,2 мл вводят внутрикожно в область спины. При этом используют тонкие (N 18 - 20) острые иглы с небольшим скосом. Кожу в месте введения взвеси предварительно освобождают от шерсти, обрабатывают 70° спиртом. В месте введения кожу растягивают пальцами левой руки, правой рукой вводят иглу под острым углом. Конец иглы должен быть виден через эпидермис: при введении материала эпидермис приподнимается в виде четко ограниченного бугорка, кожа над ним становится прозрачной и пористой. Результат учитывают ежедневно в течение 3 - 4 суток. Отмечают появление припухлости, красноты, наличие некроза. Следует иметь в виду, что вследствие неодинаковой чувствительности животных необходимо использовать не менее двух кроликов или морских свинок. Обязательно при испытании каждому животному следует ввести взвесь штамма бактерий, обладающего дермонекротической активностью (контроль чувствительности животных).

При учёте опыта размер гиперемии, отека и некроза измеряют по диаметру и выражают в мм.

Изучение "острой" токсичности

При изучении "острой" токсичности однократно вводят несколькими способами (внутривенно, внутрибрюшинно, перорально) 3 или 4 разные дозы испытуемых культур штаммов или препаратов для определения или максимально переносимой дозы. Контрольной группе животных тем же способом вводят 0,9% раствор натрия хлорида. Из той же группы оставляют интактных животных (2-ая контрольная группа). Внутривенные и внутрибрюшинные введения максимально переносимых доз позволяют выявить органы-мишени для испытуемого пробиотика, характер и степень выраженности морфологических изменений в них. Сравнение параметров токсичности при разных путях введения может дать представление о сходстве или различии в механизмах токсического действия испытуемых штаммов или препаратов и причинах летального исхода у животных.

Таблица 1 - Максимально допустимые объемы жидкости для некоторых видов лабораторных животных в зависимости от пути введения в мл

Вид животных	Масса тела (г)	Путь введения/объем введения, мл
Вид животных	Масса тела (г)	в желудок	под кожу	в мышцу	в вену	в брюшную полость
Мышь	10 - 14	0,5	0,5 - 1,0	0,5	0,2 - 0,5	0,5 - 1,0
Крыса	100 - 140	3,0	5 - 10	5,0	2,0	5,0
Морская свинка	250 - 300	4,0 - 5,0	15	5,0	5,0 - 8,0	5,0
Кролик	1500 - 2500	100	30	15,0	20	20,0 - 30,0

Максимальные объемы должны вводиться мышам в течение 5 с, крысам и морским свинкам - в течение 10 с, кроликам - в течение 20 с.

Общая продолжительность наблюдений за животными должна составлять не менее 7 суток. Ежедневной регистрации подлежат гибель животных, масса тела, а также наличие или отсутствие возможных клинических симптомов интоксикации, в т.ч. нарушение координации движения, наличие судорог, их характер, а также состояние волосяного кожного покрова, окраска слизистых оболочек, положение хвоста. Через 24 ч и 7 суток осуществляют взятие материала от внутренних органов выживших животных, не менее чем по 5 животных соответственно. Обязательному исследованию подлежат все животные, павшие в течение срока наблюдения. Перед забором внутренних органов осуществляют их визуальный осмотр. Макроскопические изменения каждого органа фиксируют в журнале. Допускается проведение гистологического исследования органов одного вида животных, оказавшегося более чувствительным к токсическому воздействию препарата. Во всех экспериментах, предусматривающих выполнение патоморфологических исследований, используют равное количество контрольных животных (после введения 0,9% хлорида натрия и интактных).

Таблица 2 - Cхема определения "острой" токсичности производственных штаммов и лекарственной формы препарата

Способ введения	Доза	Кратность введения	Срок опыта (сут.)	Срок забора внутренних органов (сут.)
Внутрибрюшинное и при необходимости внутривенное	Не менее трех доз для вычисления или максимально переносимой дозы в случае невозможности определения	Однократно	7 С ежедневной регистрацией массы тела, признаков интоксикации, гибели животных	1 и 7
Перорально	Максимально переносимая доза	Однократно	7 С ежедневной регистрацией массы тела, признаков интоксикации	1 и 7

Определение "хронической" токсичности

Общие положения

Целью хронических токсикологических экспериментов является характеристика степени повреждающего действия исследуемых штаммов или препаратов при их длительном введении, выявление наиболее чувствительных органов и систем организма, а также исследование степени обратимости вызываемых ими повреждений.

Продолжительность введения пробиотиков при изучении хронической токсичности зависит от предполагаемой длительности их применения в клинике (табл. 3).

Таблица 3 - Схема определения "хронической" токсичности производственных штаммов и лекарственной формы препарата

Способ введения

Доза

Кратность введения

Срок опыта (сут.)

Срок забора внутренних органов (сут.)

Перорально

Эквивалент* суточной человеческой дозы

Ежедневно в течение 14 или 30 сут. в зависимости от предполагаемого курса лечения

14 или 30 сут. с ежедневной регистрацией массы тела, признаков интоксикации

15 и 22

31 и 37

* Суточную дозу, эквивалентную человеческой на кг массы тела животного, рассчитывают следующим образом:

где: - масса тела животного;

ЧД - человеческая доза;

- масса тела человека (масса тела взрослого человека 70 кг, масса тела ребенка - 10 кг).

Пример расчета: г; ;

"Хроническую токсичность" определяют не менее чем на двух видах животных (или двух линиях одного вида). Обязательным путем является пероральный способ введения независимо от лекарственной формы готового препарата.

Препарат вводят не менее чем 20 животным один раз в сутки в дозе, эквивалентной предлагаемой для человека, при пересчете на 1 кг массы. Перерыв в курсе введения не допускается. Наблюдение за животными проводят в течение периода введения препарата и последующих 7 суток. Ежедневной регистрации подлежат гибель животных, масса тела, а также наличие или отсутствие возможных клинических симптомов интоксикации, в т.ч. нарушение координации движения, наличие судорог, их характер, а также состояние волосяного кожного покрова, окраска слизистых оболочек, положение хвоста. Для проведения гистологического исследования на 1 и 7 сутки после последнего введения препарата забивают по 5 животных соответственно. Гистологическому исследованию подвергают также органы всех животных, павших в течение периода наблюдения.

Допускается проведение гистологического исследования органов одного вида или линии животных, оказавшихся более чувствительными к токсическому действию препарата.

Патоморфологическое исследование

Забой животных проводят эфирным наркозом с последующей декапитацией. Вскрытие и осмотр внутренних органов проводят сразу после забоя, обращая внимание на состояние серозных покровов и содержимое полостей. Определяют, сравнивая с контролем, массу, цвет, степень кровенаполнения органов, цвет и вязкость крови, наличие кровоизлияний.

Таблица 4 - Органы, подлежащие гистологическому исследованию

Способ введения испытуемого материала	Исследуемые органы
Внутривенный	Головной мозг, печень, легкие, сердце, почки, надпочечники, тимус, лимфатические узлы разной локализации, стенка вены и подкожная клетчатка в месте введения
Внутрибрюшинный	Головной мозг, печень, легкие, сердце, почки, надпочечники, тимус, лимфатические узлы разной локализации
Пероральный	Головной мозг, печень, легкие, сердце, почки, надпочечники, тимус, корень языка, желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник, мезентериальные лимфатические узлы

Примечание. В приведенной таблице дано количество воды, которое нужно прибавить к 100 куб. см исходного спирта желаемой крепости. Например, чтобы получить 70-градусный спирт из 90-градусного, к 100 куб. см последнего надо прибавить 31,05 куб. см воды.

Фиксацию проводят в 10% растворе нейтрального формалина, для чего 1 часть 40% раствора формальдегида разводят 9 частями воды. Готовят раствор обязательно на водопроводной воде, т.к. дистиллированная вызывает набухание тканей. После промывания кусочки подвергают дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спиртах увеличивающейся концентрации. Спирты нужной крепости готовят заранее по специальной таблице разведения из 90 или 95° этилового спирта (табл. 5).

Методика окраски срезов

Депарафинирование срезов

Парафиновые срезы перед окрашиванием освобождают от парафина с помощью любого его растворителя - бензола, толуола, ксилола, бензина. Особенно тщательно удаляют парафин перед исследованием ткани в поляризационном микроскопе, т.к. парафин обладает двоякопреломляющим свойством.

Депарафинирование осуществляют по следующей схеме:

Среда	Время
Ксилол 1	10 - 15 мин., можно в термостате при 37°С
Ксилол 2	3 - 5 мин.
Спирт абсолютный 1	1 - 2 мин.
Спирт абсолютный 2	Ополоснуть
Спирт 96° 1	Ополоснуть
Спирт 96° 2	Ополоснуть
Дистиллированная вода	2 смены

После депарафинирования 100 - 350 препаратов реактивы заменяют. Для окрашивания ядер используется гематоксилин. Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха. Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96° спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Для доокрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина.

4.6.2. Методика окрашивания срезов гематоксилин-эозином

Окрашивание срезов гематоксилин-эозином наиболее часто применяется и поэтому должно быть описано более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий:

1) срезы переносят в дистиллированную воду на 5 - 10 мин.;

2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2 - 5 мин.;

3) промывают в дистиллированной воде 1 - 2 с;

4) затем промывают в водопроводной воде 3 - 5 мин.;

5) осуществляют контроль под микроскопом;

6) дифференцируют 1%-ным раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1 - 2 с;

7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин. при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;

8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);

9) промывают в дистиллированной воде 5 - 10 мин.;

10) 1%-ный водный раствор эозина 0,5 - 1,0 мин.;

11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, т.к. вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;

12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам.

В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2 - 3 срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково.

При необходимости для уточнения характера выявленных изменений могут быть использованы другие методы окраски (окраска на фибрин, липиды, мукополисахариды и т.д.).

При изучении микропрепаратов обращают внимание на следующие факторы:

1. Нарушение в системе микроциркуляции (перераспределение крови с депонированием ее в паренхиматозных органах, стаз, агрегация эритроцитов в капиллярах и тромбообразование, повышение проницаемости стенок сосудов с развитием геморрагий, плазморрагий, мукоидной, фибриноидной дезорганизации, фибриноидного некроза).

2. Дистрофические и воспалительные изменения во внутренних органах.

3. Состояние бронхиальной системы (признаки бронхоспазма, отек стенок бронхов, десквамация слизистой оболочки, присутствие эритроцитов в просвете бронхов и альвеол) и перибронхиальных лимфатических узлов.

4. Изменения миокарда, эндокарда и перикарда (отек стромы, миоцитолиз, мукоидное набухание миокардиоцитов, воспалительная инфильтрация и продуктивная реакция).

5. Характер и степень выраженности изменений в клубочковом и канальцевом аппарате почек.

6. Характер перестройки в органах иммунитета и кроветворения (тимусе, селезенке, лимфатических узлах, костном мозге).

7. Дистрофические и микроциркуляторные изменения в ЦНС.

Патологические изменения, возникающие у животных после введения высоких доз пробиотиков, дают ценную информацию для характеристики его токсических свойств. Однако эта информация должна быть подвергнута тщательному анализу и полученные результаты следует рассматривать в качестве предупреждения, а не противопоказания для клинических испытаний.

При решении вопроса о возможности передачи препарата на клиническое изучение исследователь должен учесть следующие факторы:

1. Соотношение терапевтической и безопасной дозы ( или максимально переносимой дозы).

2. Характер и обратимость выявленной патологии.

Заключение должно содержать суждения исследователей о степени воздействия штамма или препарата на внутренние органы испытуемых животных при исследовании "острой" и "хронической" токсичности для оценки возможных побочных реакций и определения необходимых ограничений при клинических испытаниях.

4.7. Содержание отчета об исследовании "острой" и "хронической" токсичности

Введение (цель и задачи исследования).

Материалы и методы (биологические характеристики производственного штамма и препарата, характеристики животных, условия их содержания, методы формирования групп и отработки доз, способы забоя животных, методы приготовления гистологических препаратов).

Результаты исследований (описание макро- и микроскопических изменений).

Заключение о наличии или отсутствии "острой" и "хронической" токсичности испытуемого штамма или препарата, указываются возможные побочные эффекты и ограничения для проведения клинических испытаний.

Результаты макро- и микроскопического исследования органов животных, получивших исследуемый препарат, препарат сравнения, а также контрольных животных регистрируют в протоколах и заносят в регистрационную карту; документируют микрофотографиями. На основании полученных результатов оформляют заключение о токсических свойствах испытуемого препарата. Указанные материалы вместе с другими формами документации представляют в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора. Гистологические препараты и парафиновые блоки сохраняют до принятия Комитетом МИБП решения по результатам доклинического испытания препарата.

Форма протокола для макроскопического исследования

Сроки опыта	Испытуемый материал	Способ введения испытуемого материала	Вид/линия животных	N животных	Описание макроскопических изменений

Форма протокола для микроскопического исследования

Сроки опыта

Испытуемый материал

Способ введения испытуемого материала

Вид/

линия

животных

N животных

Внутренние органы

ЦНС

головной мозг

Примечание. 1 - легкие, 2 - печень, 3 - селезенка, 4 - сердце, 5 - почки, 6 - надпочечники, 7 - тимус, 8 - место введения, 9 - желудок, 10 - тонкий кишечник, 11 - толстый кишечник, 12 - регионарные л/у.

Штаммы, используемые при производстве пробиотиков, должны быть ежегодно проверены по всем биологическим свойствам в соответствии с регламентированными требованиями:

Подлинность. Штамм должен быть идентифицирован до вида с помощью микробиологических методов (например, микроскопического, бактериологического или культурального, биохимического и т.п.), которые могут быть дополнены методами молекулярной биологии (например, амплификация нуклеиновых кислот или секвенирование для подтверждения стабильности генома штамма). Штамм должен обладать однородными морфологическими, тинкториальными, биохимическими и культуральными свойствами без признаков диссоциации.

Специфическая безопасность. Безопасность штамма определяется биологическими методами in vivo (например, исследованием безвредности, токсичности, токсигенности, вирулентности и т.п.) в соответствии с ОФС "Безопасность пробиотиков", которые могут быть дополнены методами молекулярной биологии для подтверждения стабильности первоначальных биологических свойств.

Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов. Испытание выполняют с использованием разнообразных селективных питательных сред для того, чтобы в выбранных условиях инкубации был обеспечен рост контаминантов. Штамм не должен содержать посторонней микрофлоры. Определение проводят в соответствии с ОФС "Микробиологическая чистота".

Антагонистическая активность. Антагонистическую активность штамма в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов определяют микробиологическим методом, например, отсроченного антагонизма на плотной среде по зонам задержки роста тест-штаммов или методом совместного культивирования (определение проводят в соответствии с ОФС "Специфическая активность пробиотиков для медицинского применения"). Штамм должен проявлять антагонистическую активность по отношению к тест-штаммам патогенных и условно патогенных микроорганизмов, не должен угнетать рост представителей нормофлоры. Тест-штаммы должны быть депонированы в национальной или международной коллекции с указанием источника и даты выделения, характеристики биологических свойств. Перечень тест-штаммов для контроля антагонистической активности определяют на основании результатов клинических (лечебное действие) и микробиологических (влияния на определенную группу патогенных и условно патогенных микроорганизмов) испытаний эффективности и безопасности конкретных групп препаратов.

Кислотообразующая активность. Определение активности кислотообразования препарата проводят титриметрическим методом в соответствии с ОФС "Специфическая активность пробиотиков для медицинского применения". Кислотность выражают в градусах Тернера (°Т).

Хранение, упаковка. Производственный штамм, расфасованный в первичную упаковку (ампулы, флаконы), в лиофилизированном виде хранят при температуре, обеспечивающей его стабильность.

Коллекцию производственного штамма хранят в специальном помещении при температуре минус 15 - 20°С. Производственный штамм регистрируют в специальном журнале, в который вносят движение производственного штамма и все результаты контроля. За производственный штамм несет ответственность определенный назначенный сотрудник.

Производственный штамм, находящийся в коллекции предприятия, проверяется 1 раз в год по всем показателям, утвержденным в разработанной для него нормативной документации.

III. Этап получения посевной культуры.

Посевную культуру микроорганизмов получают из производственного штамма, выращенного на оптимальной питательной среде (не более 4-го пассажа) в соответствующих условиях методом поверхностного или глубинного культивирования с последующей лиофилизацией в количестве, необходимом для обеспечения производства посевной культурой на протяжении года, если в частной фармакопейной статье не указаны другие требования.

При необходимости использования штамма при производстве лекарственной формы препарата готовят посевную серию штамма в количестве, необходимом для выпуска определенного количества серий препарата. Для этого из коллекции штаммов берут 2 - 3 ампулы полностью отконтролированного штамма и осуществляют его посев на оптимальные для штамма питательные среды. Для высушивания посевной серии штамма используют 2 - 4-ый пассаж. Штамм может быть высушен в вакуумных ампулах или во флаконах, обеспеченных вакуумной крышкой. На этикетку ампул, флакона наносят следующие сведения: наименование штамма, порядковый номер серии, дата лиофилизации, срок годности, номер хранилища или контейнера.

Производственную серию штамма контролируют 2 раза в год по основным показателям качества, указанным в нормативной документации. Результаты контроля фиксируют в специальном журнале и отражают в паспорте штамма.

Посевная культура должна соответствовать требованиям:

Подлинность. Подлинность посевной культуры определяется микробиологическими методами. Культура должна обладать однородными морфологическими и культуральными свойствами без признаков диссоциации.

Специфическая безопасность.

Посевная культура должна быть безопасна при внутрибрюшинном, внутривенном, пероральном введении мышам массой тела г. Вид испытания определяется индивидуально в зависимости от видовой принадлежности посевной культуры и способа назначения лечебного препарата). Испытание проводят в соответствии с ОФС "Безопасность пробиотиков в опытах in vivo".

Хранение, упаковка. Посевную культуру хранят в лиофильно высушенном состоянии при температуре, обеспечивающей сохранения первоначальных биологических свойств на протяжении срока годности. На ампулу (флакон) высушенного штамма наносят следующие сведения: наименование и номер штамма, дата лиофилизации, порядковый номер лиофилизации, срок годности.

Посевную серию штамма контролируют 2 раза в год по основным показателям качества, указанным в нормативной документации. Результаты контроля фиксируют в специальном журнале и отражают в паспорте штамма.

Приложение.

Приложение 1

Способы окраски мазков

Окраска по методу Грама

1. Фиксированный на огне мазок окрашивают генциан-, метил- или кристаллвиолетом 2 мин. (положив на мазок фильтровальную бумагу, пропитанную краской).

2. Наливают раствор Люголя на 2 мин. Мазок приобретает серо-бурую окраску.

3. Сливают раствор Люголя.

4. Для обесцвечивания вносят несколько капель 70° спирта на 2 мин.; следят, чтобы он равномерно распределился по поверхности всего мазка.

5. Препарат промывают водой.

6. Докрашивают фуксином Пфейффера 2 мин.

7. Бумажку снимают, препарат промывают водой.

8. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.

Результат окраски: грамположительные бактерии окрашиваются основной краской в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.

Окраска по методу Циля-Нильсена

1. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают в течение 3 - 5 мин. раствором карболового фуксина Циля или окрашенной фуксином бумажкой с подогреванием до появления паров, но не доводя краситель до кипения.

2. Дают препарату остыть, бумажку снимают, сливают избыток красителя, препарат промывают водой.

3. Окрашенный препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение 3 - 5 с или 96° этиловым спиртом, содержащим 3% по объему хлористоводородной кислоты, несколько раз погружая стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом.

4. После обесцвечивания остаток кислоты сливают и тщательно промывают препарат водой.

5. Докрашивают дополнительно метиленовым синим Лёффлера 3 - 5 мин.

6. Окрашенный препарат промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

При окраске препаратов кислоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново-красный цвет и не обесцвечиваются кислотой.

Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты обесцвечиваются и приобретают цвет дополнительного красителя.

Окраска по методу Бурри для выявления капсул

На узкий конец предметного стекла наносят каплю туши в петлю исследуемого материала. Смесь перемешивают тщательно петлей, делают мазок, как мазок из крови, высушивают на воздухе и, не фиксируя, микроскопируют с иммерсионной системой. Фон препарата окрашен в темно-дымчатый цвет, микробные тела и их капсулы не окрашиваются тушью и остаются бесцветными, вследствие чего этот способ получил название негативного.

Окраска по методу Гинса для выявления капсул

1. Приготавливают негативно окрашенный по методу Бурри препарат.

2. Фиксируют любым химическим способом: метиловым спиртом, смесью Никифорова или другими смесями.

3. Промывают водой.

4. Окрашивают карболовым фуксином Циля, разведенным 1:3, в течение 3 - 5 мин.

5. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.

При микроскопировании на темном фоне препарата контрастно выделяются неокрашенные капсулы, внутри которых находятся бактерии ярко-малинового цвета.

Окраска по методу Ожешко - для выявления спор

1. На высушенный нефиксированный препарат (мазок готовится толстым и на краю стекла) наливают несколько капель 0,5% раствора соляной кислоты и подогревают 1 - 2 мин. над пламенем горелки до закипания, после чего остатки кислоты сливают.

2. Остывший препарат промывают водой, подсушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.

3. Окрашивают карболовым фуксином Циля (фуксин наливают на фильтровальную бумажку) с подогреванием до появления паров.

4. Обесцвечивают 5%-ным раствором серной кислоты в течение нескольких секунд.

5. Промывают водой.

6. Докрашивают синькой Лёффлера или 1% водным раствором малахитовой зелени в течение 3 - 5 мин.

Споры, окрашенные фуксином, имеют рубиново-красный цвет, вегетативные тела микробных клеток при докрашивании синькой Лёффлера - синий цвет, при применении малахитовой зелени - зеленый цвет.

Окраска по методу Пешкова - для выявления спор

1. На фиксированный мазок наливают синьку Лёффлера и дают краске закипеть. Окрашивание мазка происходит кипящей синькой в течение 20 - 30 с.

2. Препарат промывают водой.

3. Докрашивают 0,5% водным раствором нейтральрота в течение 30 - 60 с.

4. Промывают водой и высушивают. Споры, окрашенные синькой Лёффлера, имеют голубой цвет, вегетативные тела бактерий - красный цвет.

Окраска по методу Нейссера - для выявления зерен волютина

1. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают 1 - 2 мин. синькой Нейссера.

2. Синьку сливают, на препарат наносят несколько капель раствора Люголя на 1 мин.

3. Мазок промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой.

4. Докрашивают в течение 2 мин. раствором хризоидина или 1 - 3 мин. раствором везувина.

5. Промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

Зерна волютина окрашиваются в синий цвет, тела микробных клеток - в светло-коричневый цвет.

Окраска по методу Романовского-Гимза

Краска Романовского-Гимза состоит из смеси азура, эозина и метиленовой сини. Непосредственно перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды нейтральной или слабо щелочной реакции (pH 7,0 - 7,2) прибавляют 10 капель коммерческого красителя Романовского-Гимза. Приготовленный раствор краски тотчас же наливают на фиксированный мазок или лучше предметное стекло с окрашиваемым препаратом погружают в стаканчик с краской. Через 1 ч краску сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Краска Романовского-Гимза, имеющая в растворе сине-фиолетовый цвет, окрашивает протоплазму форменных элементов ткани в голубовато-синий цвет, а ядра клеток, также как и микробные тела, в фиолетово-красный.

Приложение 2

Рецепты приготовления красок и реактивов, необходимых для окрашивания бактериальных препаратов

1. Приготовление насыщенных спиртовых растворов красок

Для приготовления 100 мл спиртового насыщенного раствора берут следующие количества красок:

     а) основного фуксина                          8 - 9 г;

     б) метиленовой сини                           8 - 9 г;

     в) генциан-, (кристалл-, или метилвиолета)    5 - 10 г.

Порошки красок в количествах, указанных выше, высыпают во флаконы, заливают спиртом и ставят на 18 - 24 ч в термостат при 37°С, периодически взбалтывая. В течение указанного времени значительная часть красок растворяется, на дне флакона остается лишь небольшой осадок, свидетельствующий о насыщении раствора.

Насыщенные растворы красок могут храниться долгое время во флаконах из темного стекла.

2. Спирто-водные растворы красок

Спирто-водные растворы готовятся из насыщенных спиртовых растворов в следующих соотношениях:

1. Спирто-водный раствор фуксина: 1 мл насыщенного раствора фуксина на 10 мл дистиллированной воды.

2. Спирто-водный раствор метиленовой сини: 1 мл насыщенного раствора краски на 30 мл дистиллированной воды.

3. Спирто-водный раствор генциан-, метил- или кристаллвиолета: 1 мл насыщенного раствора на 10 мл дистиллированной воды.

3. Карболовый раствор генциан- (метил- или кристалл-) виолета

     Метил- (кристалл- или генциан-) виолета           1 г

     Карболовой кислоты кристаллической                2 г

     Спирта 96°                                        10 мл

     Воды дистиллированной                             100 мл

Карболовый раствор метил- (генциан- или кристалл-) виолета готовят аналогично 1-ой прописи карболового раствора фуксина Циля или следующим образом: смешивают 10 мл насыщенного спиртового раствора краски со 100 мл 2% карболовой кислоты; полученную смесь тщательно взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр. Растворы метил- (генциан-, кристалл-) виолета нестойкие, поэтому их приготовление в большом количестве с расчетом на длительное хранение не рекомендуется.

4. Раствор Люголя

     Кристаллического йода                            1 г

     Йодистого калия                                  2 г

     Дистиллированной воды                            300 мл

Йодистый калий растворяют в 5 - 10 мл дистиллированной воды, затем прибавляют кристаллический йод, жидкость сильно взбалтывают до полного растворения йода и после доливают остальное количество воды.

5. Карболовый фуксин Циля

     Основного фуксина в порошке                      1 г

     Карболовой кислоты кристаллической               5 г

     Глицерина                                        0,5 мл

     Спирта 96°                                       10 г

     Воды дистиллированной                            100 г

Пропись первая. 1 г основного кристаллического фуксина Циля растирают в фарфоровой ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и несколькими каплями глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют спирт. После того как краска хорошо разотрется, доливают при постоянном помешивании 100 мл дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через влажный бумажный фильтр. Фуксин Циля очень стойкий и может храниться долгое время во флаконе с притертой пробкой.

Пропись вторая. К 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина доливают 90 мл 5% карболовой кислоты (карболовую кислоту вливают в краску, а не наоборот). Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют через бумажный фильтр и после этого сливают во флакон для хранения.

Разведенный фуксин или спирто-водный раствор Пфейффера. К 1 части карболового фуксина Циля приливают 9 частей дистиллированной воды. Раствор очень нестойкий, поэтому его готовят в небольших количествах непосредственно перед употреблением.

6. Метиленовая синь (Лёффлера)

     Насыщенного спиртового раствора

     Метиленовой сини                                30 мл

     Дистиллированной воды                           100 мл

     Едкого калия 1%                                 1 мл

Насыщенный раствор метиленовой сини фильтруют через бумажный фильтр, прибавляют к нему едкий калий и разбавляют дистиллированной водой. Приготовленный таким образом раствор краски может храниться во флаконе в течение длительного времени, не изменяя свойств.

7. Водный раствор малахитовой зелени

     Малахитовой зелени в порошке                     5 г

     Дистиллированной воды                            100 мл

Указанное количество малахитовой зелени ссыпают во флакон и заливают горячей дистиллированной водой, ставят на сутки в термостат, периодически взбалтывая. На дне флакона остается небольшой осадок, свидетельствующий о насыщении раствора.

8. Нейтральный красный (нейтральрот) водный раствор

     Нейтральрота (0,5% раствор)                      0,5 г

     Нейтральрота (1% раствор)                        1 г

     Нейтральрота (1,5% раствор)                      1,5 г

     Дистиллированной воды (кипящей)                  100 мл

Водный раствор краски готовят так же, как раствор хризоидина. Порошок краски, количество которой соответствует необходимой концентрации раствора, высыпают на стенки бумажного фильтра, находящегося в воронке, и заливают кипящей дистиллированной водой. При длительном стоянии из раствора краски выпадает осадок в виде микроскопических игольчатых кристаллов. При образовании осадка краску профильтровывают, после чего она вновь становится пригодной к употреблению.

9. Синька Нейссера

Готовят отдельно два основных раствора:

     первый раствор:

     метиленовой сини                                 0,1 г

     этилового спирта 96°                             2 мл

     ледяной уксусной кислоты                         5 мл

     дистиллированной воды                            100 мл

     второй раствор:

     кристаллвиолета                                  1 г

     этилового спирта 96°                             10 мл

     дистиллированной воды                            300 мл.

Для окраски зерен волютина непосредственно перед окраской смешивают 2 ч. первого раствора с 1 ч. второго раствора.

10. Водный раствор хризоидина

     Хризоидина в порошке                             1 г

     Дистиллированной воды                            150 г

В воронку на бумажный фильтр насыпают отвешенное количество краски, после чего вливают указанное количество кипящей воды.

Везувин или бисмаркбраун (коричневая краска)

     Везувина в порошке                               2 г

     Спирта этилового 96°                             60 мл

     Дистиллированной воды                            40 мл

Перечисленные ингредиенты смешивают, нагревают до кипения на слабом огне и после остывания фильтруют через бумажный фильтр.

11. Приготовление красящих бумажек по Синеву

Для приготовления красящих бумажек пользуются стандартной фильтровальной бумагой, которую предварительно испытывают на пригодность. Для этого отрезают полоску бумаги и погружают в спиртовой раствор краски, затем высушивают на воздухе. Хорошая бумага окрашивается равномерно без пятен. Затем от нее отрезают небольшой кусок и кладут на стекло с несколькими каплями воды. Пригодная для окраски бумага сразу пропитывается водой и через несколько секунд "отдает" краску, вследствие чего вода вокруг становится интенсивно окрашенной в соответствующий цвет. Если этого не происходит, бумага для приготовления красящих бумажек не пригодна.

Техника приготовления красящей бумаги. Краску, предназначенную для пропитывания бумаги, наливают в лоток или глубокую тарелку. Бумагу нарезают в виде полосок шириной 2 - 2,5 см и длиной 30 - 50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краску так, чтобы смачивались обе ее поверхности. Окрашенные полосы вынимают пинцетом, дают краске стечь и подвешивают на веревке для высушивания. Бумагу сушат на воздухе при комнатной температуре или в термостате при 37 - 50 °С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2 х 2 см или 2,0 х 4,5 см.

Прописи растворов красок для приготовления бумаги.

1. Кристалл- (генциан- или метил-) виолет для окраски по Грамму

     Кристаллвиолета                               1 г

     Спирта этилового 96°                          100 мл

     Глицерина                                     5 мл

2. Фуксин (основной)

     Фуксина                                       2 г

     Спирта этилового 96°                          100 мл

     Глицерина                                     1 мл

3. Фуксин карболовый Циля

На 100 мл приготовленной краски прибавляют 1 - 2 мл глицерина.

4. Метиленовая синь

     Метиленовой сини                              1 г

     Спирта этилового 96°                          100 мл

     Глицерина                                     1 мл

5. Малахитовая зелень

     Малахитовой зелени                            5 г

     Дистиллированной воды горячей                 100 мл

     Глицерина                                     5 мл

<< Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42 "Общие принципы анализа...		>> Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья Анатоксин стафилококковый очищенный адсорбированный,...
	Содержание Информация Министерства здравоохранения РФ от 24 сентября 2013 г. "Общие фармакопейные статьи и фармакопейные статьи...

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас