Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина брюшнотифозная Ви-полисахаридная"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина брюшнотифозная Ви-полисахаридная"

Вводится впервые

Вакцина для профилактики брюшного тифа

Вакцина брюшнотифозная Ви-полисахаридная представляет собой раствор капсульного полисахарида, извлеченного из супернатанта культуры Salmonella typhi. Технология получения вакцины брюшнотифозной Ви-полисахаридной предусматривает культивирование производственного штамма (штамма-продуцента) в жидкой синтетической питательной среде, выделение из полученной биомассы капсульного Ви-полисахарида, лиофилизацию неочищенного Ви - полисахарида, его очистку, лиофилизацию очищенного Ви-полисахарида.

Производственный штамм Salmonella typhi должен отвечать следующим требованиям:

- на плотной питательной среде образовывать круглые, гладкие, выпуклые, блестящие колонии (S-формы);

- на висмут-сульфит агаре образовывать черные, блестящие колонии;

- в мазках, окрашенных по Граму, должны присутствовать грамотрицательные палочки с закругленными концами;

- должен ферментировать глюкозу, маннит и мальтозу с образованием кислоты без газа;

- должен продуцировать сероводород;

- не должен ферментировать лактозу и сахарозу;

- не должен образовывать индол;

- производственного штамма должна быть не более 20 микробных клеток при внутрибрюшинном введении в 5% муцине третьего типа белым беспородным мышам массой 16-20 г.

Производство

Технология получения вакцины брюшнотифозной Ви-полисахаридной предусматривает культивирование производственного штамма (штамма-продуцента) в жидкой синтетической питательной среде, выделение из полученной биомассы капсульного Ви-полисахарида, лиофилизацию неочищенного Ви-полисахарида, его очистку, лиофилизацию очищенного Ви-полисахарида.

Производство вакцины включает в себя следующие этапы:

- получение биомассы и ее дезактивация;

- получение неочищенного Ви-антигена;

- лиофилизация неочищенного Ви-антигена;

- очистку Ви-антигена и его лиофилизацию;

- получение готовой формы препарата.

На этапе культивирования используют синтетическую питательную среду. Полученную биомассу контролируют на бактериологическую чистоту и типичность морфологии. Инактивацию проводят фенолом, по окончании процесса оценивают специфическую стерильность биомассы.

Полученную инактивированную культуральную жидкость центрифугируют, супернатант подвергают концентрированию и диализу. Концентрат Ви-антигена лиофилизируют, полученный после лиофилизации продукт контролируют по массе и Ви- и О-специфической активности.

Этап очистки предусматривает очистку от нуклеиновых кислот, балластных белков и диализ Ви-антигена. Лиофильно высушенный препарат очищенного Ви-антигена - субстанция для приготовления готовой формы препарата.

Испытания субстанции.

Описание. Белый аморфный порошок.

Подлинность. Линия преципитации 0,01% раствора субстанции должна быть идентичной линии преципитации стандартного образца (СО). Оценивается в реакции преципитации в геле по Оухтерлони с монорецепторной Ви-сывороткой (см. тест "Подлинность" разд. "Испытания готового продукта").

Белок. Не более 1,0%. Испытания проводят методом Лоури без предварительного осаждения белка в соответствии с ОФС "Определение белка". Субстанцию предварительно растворяют в воде очищенной до концентрации 5,0 мг/мл.

Нуклеиновые кислоты. Не более 2,0%. Испытания проводят методом Спирина в соответствии с ОФС "Определение нуклеиновых кислот по Спирину". Субстанцию предварительно растворяют в воде очищенной до концентрации 1,0 мг/мл.

О-ацетильные группы. Не менее 2,0 мкмоль/мг. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Определение О-ацетильных групп". Субстанцию предварительно растворяют в воде очищенной до концентрации 1,0 мг/мл.

Молекулярные параметры. Не менее 50% полисахарида должно элюироваться в объеме до Kd=0,25. Определяют методом гель-фильтрации, используя сефарозу. Используют колонку длиной около 0,4 м, с внутренним диаметром 9 мм, уравновешенную 0,2 М раствором натрия хлорида. Через колонку пропускают около 0,9 мг лиофилизата субстанции в объеме 0,5 мл раствора 0,2 М натрия хлорида и элюируют при скорости около 14 мл/час. Элюирующиеся фракции регистрируют при помощи ультрафиолетового детектора при 206 нм. Выход полисахарида оценивают по площади пиков до и после Кd=0,25.

Калибровку колонки для определения полного (Vt) и свободного (Vo) объема колонки проводят с помощью калибровочного раствора, содержащего голубой декстран и натрия азид, в условиях, описанных выше.

Вычисление объема колонки , соответствующего Кd = 0,25, проводят по формуле:

,

где - свободный объем колонки, мл (объем элюции голубого декстрана), мл;

- общий объем колонки с гелем, мл (объем элюции натрия азида), мл;

0,25 - коэффициент распределения вещества на колонке.

Пересчитывают значение в мм и находят на хроматограмме:

Показатели	Значение в мл	Значение в мм
Общий объем колонки
Объем фракции

Пики, элюирующиеся до и после Kd = 0,25 (значение на хроматограмме, мм), интегрируют вручную.

Содержание полисахарида в субстанции вакцины, элюировавшегося до Kd=0,25, выраженное в процентах, определяют по формуле:

, где:

А - содержание полисахарида в субстанции вакцины до Кd=0,25,%;

- площадь пика, элюировавшегося до Кd=0,25;

- суммарная площадь пиков, элюировавшихся до и после Кd=0,25.

Примечания.

Раствор для калибровки хроматографической колонки. 1 мг натрия азида растворяют в 1 мл 0,2 М раствора натрия хлорида. Полученный 0,1% раствор натрия азида перемешивают на шейкере в течение 1 минуты.

0,5 мг голубого декстрана растворяют в 0,5 мл 0,2 М раствора натрия хлорида. Полученный раствор перемешивают на шейкере в течение 1 минуты. Добавляют в полученный раствор голубого декстрана 40 мкл 0,1% раствора натрия азида и быстро перемешивают на шейкере. Раствор для калибровки хроматографической колонки готовят непосредственно перед использованием.

0,2 М раствор натрия хлорида. В мерную колбу вместимостью 1 л помещают 500 мл воды очищенной, прибавляют 11,7 г натрия хлорида и доводят до метки водой очищенной. Полученный раствор перемешивают на магнитной мешалке в течение 5 минут. Хранят при температуре 4 - 8°С. Срок хранения - 1 мес.

Испытуемый раствор.  мг лиофилизата субстанции растворяют в 0,5 мл 0,2 М раствора натрия хлорида. Полученный раствор перемешивают на шейкере в течение 2 минут. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

Специфическая активность. Содержание Ви-антигена в субстанции должно быть от 70 до 130%. Испытания проводят методом ракетного иммуноэлектрофореза (см. тест "Специфическая активность" разд. "Испытания готового продукта").

Пирогенность. Субстанция должна быть апирогенной. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность". Тест-доза 0,050 мкг/мл в 1,0 мл раствора натрия хлорида 0,9% на 1,0 кг массы животного.

Аномальная токсичность. Субстанция должна быть нетоксичной. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность", (тест для вакцин и сывороток).

Готовят раствор субстанции в концентрации 100,0 мкг в 1,0 мл раствора натрия хлорида 0,9%. Тест-доза морским свинкам - 1,0 мл испытуемого раствора подкожно, мышам - 0,5 мл испытуемого раствора внутрибрюшинно.

Испытания готового продукта

Описание. Бесцветная прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость с запахом фенола. Определение проводят органолептически.

Подлинность. Вакцина брюшнотифозная с Ви-сывороткой* должна давать дугу преципитации идентичную стандартному образцу (СО) Ви-антигена. Оценивается в реакции преципитации в геле по Оухтерлони.

Для постановки реакции пластиковую или стеклянную пластины размером 8,5 на 9,5 см заливают 1% гелем агарозы (BioRad, каталожный номер 162-01-02 или аналогичная) в количестве 12 мл, приготовленном на 0,9% растворе натрия хлорида. В застывшем слое геля с помощью пробойника и специального трафарета делают лунки: одну центральную, остальные - на периферии. Диаметр лунок - 0,4 см, расстояние между ними должно быть - 0,4 см. В центральную лунку вносят 15 мкл раствора Ви-сыворотки (титр не ниже 1: 800), в периферические - по 15 мкл стандартного образца и испытуемой вакцины, а также 0,9% раствор натрия хлорида в качестве отрицательного контроля. Затем пластину помещают во влажную камеру на 24-48 ч. Вакцину считают подлинной, если линия преципитации вакцины в отношении монорецепторной Ви-сыворотки идентична линии преципитации стандартного образца.

Прозрачность. Прозрачная или опалесцирующая жидкость не более эталона 1. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Прозрачность и степень мутности жидкостей".

Цветность. Бесцветная жидкость. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Степень окраски жидкостей".

Механические включения. Видимые механические включения должны отсутствовать. Определение проводят визуально в соответствии с ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

рН. От 6,7 до 7,3. Испытания проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Извлекаемый объем. Не менее номинального. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения".

Стерильность. Вакцина должна быть стерильна. Испытания проводят методом прямого посева в соответствии с ОФС "Стерильность".

Пирогенность. Вакцина должна быть апирогенной. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность". Препарат разводят апирогенным 0,9% раствором натрия хлорида до конечной концентрации 0,025 мкг/мл (к 0,1 мл препарата добавляют 1,9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая концентрацию 2,5 мкг/мл; после тщательного перемешивания отбирают из полученного раствора 0,1 мл разведенного препарата и прибавляют 9,9 мл 0,9% натрия хлорида). Вводят кроликам из расчета 1 мл раствора вакцины (0,025 мкг) на 1 кг массы животного.

Аномальная токсичность. Вакцина должна быть нетоксичной. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность" (Тест для вакцин и сывороток). Тест-доза для морских свинок - 1,0 мл подкожно; для мышей - 0,5 мл внутрибрюшинно.

Специфическая активность. 1 доза должна содержать (25_7,5) мкг Ви-антигена. Определяют методом ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ).

В химическую пробирку с 16 мл расплавленного и охлажденного до температуры 56°C 1% геля агарозы вносят 0,5 мл сыворотки против Ви-антигена S.typhi (титр не ниже 1 : 800) и перемешивают. Содержимое пробирки выливают на предварительно подготовленную стеклянную пластинку размером 6 мм х 12 мм, установленную на горизонтальной поверхности. Пластинка должна покрыться гелем агарозы равномерно и полностью. Толщина геля должна составлять  мм. После застывания геля агарозы пластинку накладывают на трафарет и пробивают лунки пробойником диаметром 4 мм, после чего удаляют гель из лунок с помощью вакуумного насоса или иглы.

В катодную и анодную части электрофоретической камеры заливают по 800 мл 1-кратного трис-боратного буферного раствора и охлаждают заполненную буферным раствором камеру до 4°С в холодильной установке. Охлажденную камеру вынимают, помещают в нее пластину таким образом, чтобы край пластины с лунками находился у анодной части.

Электродные мостики для соединения гелевой пластины с буферным раствором готовят из 4-х слоев фильтровальной бумаги размером 6 х 12 см. С их помощью соединяют поверхность агарозы с трис-боратным буферным раствором. Расстояние от края мостика до лунок должно быть не менее 15 мм. В лунки автоматической пипеткой вносят последовательно по 15 мкл раствора СО Ви-антигена с концентрацией 5; 10; 15; 20 мкг/мл для калибровочного графика и образец анализируемой вакцины, предварительно разведенный в 5 раз. Включают прибор в сеть и проводят электрофорез при напряжении 180-200 V при постоянной силе тока 10 мА в течение 4 ч. Каждую пробу вносят в 2 лунки. Время от начала нанесения образцов до включения прибора не должно превышать 10 минут. Пластинку переносят в кювету с 0,9% раствором натрия хлорида и выдерживают 15-20 ч при температуре 18-20 °С для отмывания от сыворотки, после чего пластинку вынимают, накрывают фильтровальной бумагой, прокалывают иглой бумагу над лунками и высушивают на воздухе при температуре 18 - 20°С. После высушивания геля агарозы пластинку с гелем переносят в кювету с красителем на 20-25 мин, а затем в кювету с раствором для обесцвечивания окрашенных гелей на 15-20 мин, далее промывают в водопроводной воде и высушивают при температуре 18-20°С. Измеряют высоту пика (h) от края лунки до внешнего края пика. Строят калибровочную кривую зависимости высоты пика ("ракеты") СО (ось ординат) от концентрации Ви-антигена в СО (ось абсцисс) - 5; 10; 15; 20 мкг/мл). По калибровочной кривой находят концентрацию Ви-антигена в анализируемой вакцине с учетом предварительного разведения. Содержание Ви-антигена в процентах (%) рассчитывают по формуле:

, где

С - концентрация Ви-антигена в анализируемой вакцине, найденная по калибровочному графику, с учетом предварительного разведения, мкг/мл; 50 - среднее номинальное значение содержания Ви-антигена в 1 мл анализируемой вакцины, мкг.

Построение калибровочного графика. Стандартный образец (СО) содержания Ви-антигена разводят, исходя из аттестованного значения, до концентрации 20 мкг/мл в соответствии с инструкцией. К 0,1; 0,2; 0,3 мл полученного раствора добавляют воду очищенную до конечного объема 0,4 мл. В пробирку, содержащую 0,4 мл раствора СО, воду очищенную не добавляют. Концентрация Ви-антигена в пробах - 5, 10, 15, 20 мкг/мл соответственно. Растворы используют свежеприготовленными.

Примечания.

Испытуемый раствор. Образец анализируемой вакцины разводят в 5 раз. Для этого к содержимому ампулы добавляют 2 мл 0,5 кратного трис-боратного буферного раствора с трилоном Б, рН 8,6 - 8,8.

5-кратный трис-боратный буферный раствор с трилоном Б, рН 8,6 - 8,8 (в тексте - 5-кратный трис-боратный буферный раствор). 60,5 г трис-(оксиметил)-аминометана, 6 г трилона Б, 19 г кислоты борной последовательно растворяют водой очищенной в мерной колбе объемом 1 л и доводят объем водой очищенной до метки. Хранят при температуре 2-8 °С. Срок годности 6 мес.

1-кратный трис-боратный буферный раствор с трилоном Б, рН 8,6 - 8,88 (в тексте - 1-кратный трис-боратный буферный раствор). 320 мл 5-кратного трис-боратного буферного раствора помещают в колбу или стакан вместимостью 2,0 л. Затем прибавляют 1280 мл воды очищенной. Перемешивают. Хранят при температуре 2-8°С. Срок годности 6 мес.

0,5-кратный трис-боратный буферный раствор с трилоном Б, рН 8,6 - 8,88 (в тексте - 0,5-кратный трис-боратный буферный раствор). 20,0 мл 5-кратного трис-боратного буферного раствора помещают в мерную колбу объемом 200 мл. Доводят объем мерной колбы до 200 мл водой очищенной. Тщательно перемешивают. Хранят при температуре 2-8 °С. Срок годности 6 мес.

1% гель агарозы. 2 г агарозы L помещают в колбу вместимостью 250 мл, затем наливают в колбу 198 мл 0,5-кратного трис-боратного буферного раствора. Перемешивают. Помещают колбу в кипящую водяную баню, прикрыв горлышко колбы ватно-марлевой пробкой. Выдерживают при постоянном перемешивании до полного расплавления агарозы (раствор становится прозрачным, без пузырьков воздуха) в течение 1,5-2 час. Устанавливают 12 пробирок вместимостью 20 мл в штатив. Разливают полученную смесь по 16 мл в стеклянные химические пробирки вместимостью 20 мл. Выдерживают пробирки до полного застывания геля (1,0-1,5 час) при комнатной температуре. Укупоренные пробирки хранят при температуре 4-8°С. Срок хранения - 12 мес .

Краситель кумасси R. К 2 г кумасси бриллиантового голубого R-250, помещенного в колбу, прибавляют 180 мл этилового спирта ректификованного 96%, 180 мл воды очищенной и 40 мл кислоты уксусной ледяной. Перемешивают. Срок хранения - 12 месяцев. Хранят под тягой.

Раствор для отмывки красителя. В колбу помещают 450 мл спирта этилового ректификованного 96%, 100 мл уксусной кислоты и 450 мл воды очищенной. Тщательно перемешивают. Хранят под тягой. Срок годности 12 месяцев.

Раствор натрия хлорида 0,9%. 9 г натрия хлорида вносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл и доводят объем водой очищенной до метки. Хранят при 4-8°С. Срок хранения - 1 мес.

Фенол. Не более 0,75 мг/доза. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Определение фенола спектрофотометрическим методом".

Маркировка и упаковка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

Предупредительная надпись: "Для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических учреждений".

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

______________________________

* Приготовление сыворотки описано в частной фармакопейной статье.